【摘要】 目的 用体外实验探讨联合应用survivin反义寡核苷酸、基因重组融合蛋白tp40是否对膀胱移行细胞癌t24细胞具有协同抑制作用。方法 实验分为对照组、错义寡核苷酸组（ms）、反义寡核苷酸组（as）、tp40组和联合组（as+tp40）。rtpcr和western blot法检测各组细胞survivin的表达；mtt法检测各组细胞生长情况；流式细胞仪检测各组细胞凋亡率；体外成瘤实验检测各组细胞的体外锚定非依赖性生长能力。处理时间为3天。 结果 所合成as(300nm)对survivin mrna的表达具有明显抑制作用。分别从转录水平和表达水平证明了联合组下调survivin的能力最强。mtt法显示联合组用药后生长抑制更加明显（p＜0.0001）,第3天细胞存活率仅12.2%，凋亡率达到96.37％。在软琼脂糖体外成瘤实验中，tp40组和as组的体外锚定非依赖性生长的能力大大降低，联合组（tp40+as）细胞几乎没有形成克隆。结论 采用survivin反义寡核苷酸封闭survivin的表达，可以增强tp40对膀胱移行细胞癌t24细胞的生长抑制作用，呈现协同效应。
【关键词】 重组转化生长因子α；反义寡核苷酸；膀胱肿瘤；治疗
inhibitory effect of recombinant tgf alphape40 combined with survivin antisense oligonucleotides on bladder transitional cell carcinoma cells
yan xiang1,ding qiang2,zhang yuanfang2,xu yonghua3,guo hongqian1
1.department of urology,affiliated drum tower hospital, nanjing university,nanjing 210008,china;2.insitute of urology,fudan university;3.lab of molecular and cellular oncology and lab of molecular cell biology,institute of biochemisty and cell biology,shanghai institutes for biological sciences,chinese academy of sciencesabstract：objective to investigate whether the survivin antisense oligonucleotides could decrease the expression of survivin in vitro and sensitize human bladder transitional cell carcinoma t24 cells to recombinant tgf alphape40( tp40).methods the experiment cells were divided into five group,such as control group,survivin missense oligonucleotides group(ms),survivin antisense oligonucleotides group(as),tp40 group and combined group(tp40+ as).rtpcr and western blot assay was performed to detect the expression of survivin in all groups cells.mtt assay was applied to detect the cell proliferation of all groups.flow cytometry were performed to detect tp40triggered apoptosis.the tumor formation experiment of t24 cells in vitro was used to evaluate all groups cells' independent ability of anchoring growth.results the survivin antisense oligonucleotides could downregulate the expression of survivin at a concentration of 300nm.we have demonstrated from the mrna level and protein level that the combined group could downregulate the expression of survivin compared with the noncombined group powerfully.in the third day,the survival rate of the combined group cells was only 12.2%,the apoptotic rate was 96.37%,and the ability of tumor formation in vitro was very poor.conclusion survivin antisense olignucleotides could sensitize human bladder transitional cell carcinoma t24 cells to tp40 with a cooperative effect.
key words：transforming growth factor alpha; antisense oligonucleotides; bladder neoplasms; therapy
膀胱癌是泌尿系统最常见的肿瘤之一。wWw.11665.cOM有10％～15％的非浸润性膀胱癌最终发展成浸润性膀胱癌或者发生转移[1]。近年来，生物治疗为晚期膀胱癌的治疗提供了一条新的途径。先前已有研究表明重组转化生长因子α绿脓杆菌外毒素融合蛋白（tgfαpe40，简称tp40）对人膀胱癌细胞的生长具有抑制作用[1]。本研究旨在探讨联合survivin反义寡核苷酸和tp40对人膀胱癌细胞增殖的作用。
1 材料与方法
1.1 主要材料
人膀胱癌t24细胞（简称t24细胞）和基因重组tp40由中国科学院上海细胞生物学研究所合成并提供。全程硫代修饰的survivin反义寡核苷酸（as）、错义寡核苷酸（ms）和rtpcr所用引物均由赛百胜公司合成。as序列5′cccagccttccagctccttg3’[2]，ms序列5′ cccacccttgcacctccttg 3′。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 t24细胞培养在dmem（美国gibco公司）中，包含15％小牛血清（杭州四季青公司），100ku/l的青霉素和链霉素，并置于含5％ co2的37℃培养箱中培养。
1.2.2 细胞转染 将t24细胞在lipofectin（gibico/brl公司）介导下进行反义寡核苷酸的转染，操作按试剂盒说明进行。转染6h后用含15％小牛血清的dmem培养液终止反应。对照组采用含相同浓度lipofectin的无血清dmem培养液。
1.2.3 rna提取及rtpcr
采用trizol一步法提取总rna。取2μl总rna，70℃孵育10min。cdna合成（反应体系20μl）：mgcl2（25mm）4μl、rt buffer（×10）2μl、dntps（10mm）2μl、rna酶抑制剂（20u/μl）0.5μl、随机引物(50mm)1.0μl、amv 逆转录酶（25u/μl）0.8μl。逆转录条件为：25℃孵育10min，42℃孵育45min，最后95℃孵育5min。
pcr扩增（反应体系25μl）：取 2μl逆转录产物，加pcr buffer（×10）2.5μl、mgcl2（25mm）1.5μl、dntps（10mm） 0.5μl、正义引物(25mm)0.5μl、反义引物(25mm)0.5μl、taq dna聚合酶（5u/μl）0.5μl。设计survivin正义引物5′atgggtgccccgacg3′，反义引物5′atccatggcagccagct3′（基因库查找号nm_001168）。反应液先进行95 ℃初变性2min，再进行30个循环（survivin）的pcr扩增，最后72℃延伸10min。循环参数：94℃变性15s，58℃退火30s，72℃延伸30s。所有标本同时行gapdh 25个循环的pcr扩增，以此作为内对照来衡量各标本rna的质与量。pcr产物采用2%的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外线下成像。
1.2.4 western blot检测 收集t24细胞，裂解后煮沸、离心。蛋白质样品经6％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，被转移到硝酸纤维素膜上，分别用鼠抗人survivin（6e4）单克隆抗体(1∶2000)孵育。然后用辣根过氧化酶偶联的抗兔或抗鼠抗体（1∶5000）孵育。最后用增强的化学发光试剂检测。
1.2.5 流式细胞检测 收集用不同浓度的tp40处理的细胞，pbs洗涤两次后用70％乙醇4℃固定过夜。用pbs洗两次，再用800μl的propidium iodide和200μl的无dnase的rnase a染色。propidium iodide染上的细胞核的荧光强度由流式细胞仪来测定。
1.2.6 mtt法检测活细胞 细胞按3×103个/孔的密度接种于96孔板，24h后，各组分别加入100μl无血清dmem配制的干预溶液处理1、2、3天，其中tp40处理浓度为750ng/ml[1]，寡核苷酸处理浓度为300nm，并用未处理的细胞作为空白对照（仅含lipofectin的无血清dmem培养液）。转染6h后更换含15%小牛血清的dmem培养液，同时补充相应的tp40。检测时，每孔加入25μl mtt（5g/l），37℃孵育2h，每孔加入100μl extraction buffer，37℃温育过夜，最后用96空板酶标仪测其于570nm的光吸收值(a)[3]。细胞存活率由下算式计算：a实验组/a对照组×100％。
1.2.7 体外软琼脂糖成瘤实验 取对数生长期的各组细胞，用0.25％胰酶消化成单个细胞后，按2×103/1.5ml的密度重悬于0.35％软琼脂糖的dmem（含10％胎牛血清）溶液，再加入已铺入底层胶的6孔板中。经过20天培养后，每孔加入1ml的0.5mg/ml piodonitrotetrazolium villet（sigma）孵育过夜，凉干拍照。
1.3 统计学方法
采用sas version 8.2统计软件进行方差分析。p＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 survivin反义寡核苷酸对t24细胞的作用
以不同浓度的survivin反义寡核苷酸处理t24细胞48h，发现survivin反义寡核苷酸随浓度的增加对survivin mrna的表达有明显抑制作用，但在浓度达到300nm以上时，其抑制作用不再明显增加。因此在下面的实验中survivin反义寡核苷酸的处理浓度均采用300nm。
2.2 联合suivivin反义寡核苷酸和tp40对t24细胞的作用
2.2.1 rtpcr结果 survivin的电泳条带大小为426bp，gapdh条带大小为452bp。如图1所示，以gapdh作为内对照，可见as组和tp40组t24细胞survivin片段表达较ms组和空白对照组明显减弱，联合组（as＋tp40）t24细胞survivin的表达量更加降低。而ms组和空白对照组之间无明显差别。
2.2.2 western blot检测结果 survivin阳性表现为分子量为16kd的条带。如图1所示，以βactin作为内对照，可见as组和tp40组t24细胞survivin表达较ms组和空白对照组明显减弱，联合组（as＋tp40）t24细胞survivin表达更加降低。而ms组和空白对照组之间无明显差别。
2.3 t24细胞增殖的生物学特性
2.3.1 mtt检测 各组细胞的生长情况见图2，可见as和tp40均可以明显抑制t24细胞生长，但两者联合用药后（as＋tp40）的生长抑制作用更加明显（p＜0.0001），ms组较对照组无显著性差异（p＞0.05），as组较tp40组无显著性差异（p＞0.05）。联合组（as＋tp40）第1、2、3天的细胞存活率分别为65.6%、42.1%和12.2%。
2.3.2 流式细胞仪检测 图3为各组细胞的凋亡情况。可见ms组仅有9.55％细胞凋亡，和对照组的9.52％无明显差别。as组、tp40组分别有36.96％、57.15％的细胞出现凋亡，而联合组（tp40＋as）的细胞凋亡为96.37％，较单独用药组的作用更加明显。
2.3.3 体外软琼脂糖成瘤试验 我们检测了各组细胞的体外锚定非依赖性生长的能力。如图4，在软琼脂中，对照组和ms组的t24细胞显示了强大的生长能力，形成了大量克隆。与此相反，tp40组和as组的体外锚定非依赖性生长的能力则大大降低，联合组（tp40+as）细胞几乎没有形成克隆。在3次的独立重复实验中，此结果都得到了很好的重复。
3 讨论
近年来我国膀胱癌的发病率明显上升。膀胱癌多数以浸润方式生长，复发非常普遍，虽然可以用局部治疗来控制，但仍有10%～15%的非浸润性膀胱癌最终发展成浸润性膀胱癌或者发生转移。晚期膀胱癌患者更是缺乏有效的治疗方法。临床治疗效果证明化疗和放疗对预防膀胱肿瘤复发，以及治疗晚期膀胱肿瘤的疗效有限。大量的研究表明基因治疗和生物治疗是控制晚期肿瘤最有希望的手段，并可能用于预防肿瘤复发。在生物治疗和基因治疗的研究中，杀伤强度、作用靶向性和可控性一直是世界各国研究者所追求的目标。在短期内实现作用完全可控性难度极大，目前研究的热点多数集中在作用靶向性和提高作用强度上。本研究探讨了生物治疗和抗凋亡手段对膀胱肿瘤细胞的杀伤作用。
肿瘤egfr阳性表达被认为是不良分化的重要标志，高水平表达的egfr可以成为抑制膀胱肿瘤生长的导向攻击目标[4]。大量的研究表明人膀胱癌能高水平地表达egfr[5]。利用基因工程手段将tgfα cdna顺序与pe40（绿脓杆菌外毒素）片断cdna顺序连接，表达出有生物活性的tgfαpe40融合蛋白（简称tp40）。该蛋白具有与表达egfr的靶细胞特异结合的能力，因而起着导向的作用，同时携带pe40进入细胞，高效地阻断靶细胞内蛋白质合成，导致细胞死亡。先前的研究表明，tp40对膀胱癌t24细胞的生长有较强抑制作用，能够明显抑制t24细胞dna的合成，并诱导肿瘤细胞凋亡，而且这种作用具有导向性，对egfr大量表达的肿瘤细胞具有明显杀伤作用[1]。
近年来发现抗凋亡因子survivin可能参与了肿瘤的发生机制[6]，采取措施下调survivin表达可达到抑制肿瘤生长的作用[79]。研究表明在膀胱癌survivin表达明显增高，而且survivin在正常组织不表达[10]。进一步研究发现tp40可以在一定程度上下调survivin的表达，说明survivin可能参与了tp40的作用机制。本研究针对survivin合成了反义寡核苷酸，将两者联合应用发现，采用反义寡核苷酸封闭survivin的表达可以增强tp40对膀胱癌t24细胞的生长抑制作用。流式细胞仪检测证明了联合作用可以明显诱导凋亡，体外软琼脂糖成瘤实验也显示出联合作用的细胞锚定非依赖性生长能力极差。这样反过来更加证明了下调survivin表达是tp40的作用机制之一，同时也找到了一种更强有效的导向性治疗膀胱肿瘤的新办法，即联合应用tp40和survivin反义寡核苷酸治疗膀胱肿瘤。
本研究为进一步的动物实验研究和临床研究奠定了基础，为临床膀胱癌的生物治疗研究开辟了一个新的领域。
【参考文献】
［1］ 燕翔,丁强,张元芳，等.基因重组转化生长因子α绿脓杆菌外毒素融合蛋白对人膀胱癌t24细胞生长的抑制作用［j］.中华外科杂志,2004，42（23）：14571459.
［2］ olie ra,simoeswust ap,baumann b,et al.a novel antisense oligonucleotide targeting survivin expression induces apoptosis and sensitizes lung cancer cells to chemotherapy［j］.cancer res,2000,60(11): 11171123.
［３］ carmichael j,degraff wg,gazdar af,et al.evaluation of a tetrazoliumbased semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing［j］.cancer res,1987,47(4): 936942.
［４］ 徐永华.细胞生长因子和受体［j］.生命的化学,1992,12（4）：47.
［５］ 丁强,张元芳,孙逊，等.膀胱癌组织中egfr和p21蛋白的表达评价［j］.实用癌症杂志,1996,11（2）: 7678.
［６］ 燕翔,丁强.survivin与泌尿系肿瘤［j］.医学研究生学报，2004，17（8）：733736.
［７］ambrosini g,adida c,altieri dc.a novel antiapoptosis gene,survivin,expressed in cancer and lymphoma［j］.nat med.1997,3(8): 917921.
