【摘要】 目的 构建vegfr3胞外区基因真核表达载体pcdna3.1vr3，并在体外进行表达和鉴定。方法 采用 rtpcr技术，扩增c57bl/6小鼠胚胎vegfr3胞外区cdna片段，通过基因重组技术将其插入到真核表达载体pcdna3.1，构建重组质粒pcdna3.1vr3。经限制性酶切鉴定和dna 序列测定结果证实后，将重组质粒经脂质体法转染cos7细胞, western blotting检测其蛋白表达。结果 克隆了c57bl/6小鼠胚胎vegfr3胞外区cdna片段，并构建了真核表达载体pcdna3.1vr3，western blot证实目的基因可在cos7细胞中表达。结论 构建的真核表达载体pcdna3.1vr3，可在真核细胞内正确表达，这为进一步的动物实验奠定了基础。
【关键词】 vegfr3; 淋巴生成; 真核表达
construction and identification of eukaryotic expression vector of vegfr3 extracellular domain gene
chen yan, wang xicai, wu zhiping, jin congguo, gu yulan, zhou yongchun, liu xin
the third affiliated hospital of kunming medical college，tumor institute of yunnan tumor hospital, kunming 650118, china
corresponding author: wang xicai, email:[email protected]：objective to construct the pcdna3.1vr3 eukaryotic expression vector for vegfr3 extracellular domain gene. the expression and identification of the vector was carried out in vitro. methods the extracellular domain of vegfr3 encoding sequence was amplified by reverse transcriptasepolymerase chain reaction from c57bl/6 mice embryo and cloned into the hindⅲxbaⅰ sites of pcdna3.1. after confirmed by sequencing the recombinant plasmid pcdna3.1vr3 was transfected into cos7 cells and its protein expression was identified by western blot. results the extracellular domains of vegfr3 encoding sequence was successfully cloned from c57bl/6 mice embryo. and the pcdna3.1vr3 eukaryotic expression vector was constructed, which can be expressed in cos7. conclusion we successfully constructed the pcdna3.1vr3 eukaryotic expression vector which may pave a way for further studies in animals experiment.
key words：vegfr3; lymphangiogenesis; eukaryotic expression
淋巴转移是恶性肿瘤转移的一个重要途径。WWW.11665.cOm有无淋巴结转移及转移淋巴结的数目一直被认为是决定肿瘤患者临床分期、治疗方案制订和预后评估的重要因素之一。
血管内皮细胞生长因子受体3 (vascular endothelial growth factor receptor 3, vegfr3) 通过与血管内皮细胞生长因子c,d(vascular endothelial growth factorc,d, vegfc,d)特异性结合可诱导淋巴管和血管生成，对肿瘤的生长和转移起重要调控作用[12]。针对vegfr3及其配体vegfｃ或vegfd信号转导通路的抗体、药物和疫苗的研究，成为当前肿瘤生物治疗研究的热点和方向。
vegfr3是一种典型的跨膜镶嵌蛋白, 由胞外区、跨膜区、胞内区三部分构成。 胞外区由7个免疫球蛋白样超二级结构域组成，其第ⅱ个免疫球蛋白区是配体的结合位点，而其两翼的第ⅰ区和第ⅲ区对于两者结合的亲和力具有重要调节作用。
我们以vegfr3为靶点，构建了vegfr3胞外区真核表达载体pcdna3.1vr3，并在体外进行了表达检测，为探索肿瘤生物治疗新的切入点奠定基础。
1 材料与方法
1.1 菌株、细胞株、实验动物和质粒
大肠杆菌dh5α菌株由中国医学科学院医学生物研究所提供；cos7细胞株购自gibco公司；实验动物c57bl/6孕鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，spf级，合格证号为“scxk（京）20020003”；pcdna3.1质粒购自invitrogen公司。
1.2 主要试剂和仪器
低熔点琼脂糖、 预染sds蛋白分子量标准、蛋白含量检测试剂盒购自biorad公司；蛋白胨、酵母提取物购自oxoid公司；限制性内切酶hindⅲ、xbaⅰ购自promega公司；trizol试剂、lipofectamine试剂购自invitrogen公司；rtpcr试剂盒、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自qiagen公司；dl2000分子量标准、dna连接酶试剂盒购自takara公司；generulertmdna分子量标准为bbi公司产品；羊抗鼠vegfr3抗体购自abcam公司；兔抗羊igg购自chemicon公司；protein detectertm elisa试剂盒购自kpl公司；硝酸纤维素膜、ecl显色试剂盒购自biosciences公司。
pcr仪为mj research公司产品，凝胶成像系统为syngene公司产品，电泳仪为biorad公司产品，低温高速离心机购于heraeus公司，二氧化碳培养箱、生物安全柜、超低温冰箱均为forma公司产品。
1.3 重组质粒pcdna3.1vr3的构建
使用trizol试剂提取总rna。核酸蛋白定量仪(biorad)测定rna纯度， 1％琼脂糖凝胶电泳检测总rna完整性。
以gene bank vegfr3（gi 6679812） 胞外区cdna序列为目的基因，使用primer premier 5.00引物设计软件，设计如下引物，p1的5′端所带限制性酶切位点为hindⅲ，p2的5′端所带限制性酶切位点为xbaⅰ：
上游引物p1：5′aagcttgccaccatgggt
tactccatgacccctc3′
下游引物p2：5′gctctagattaactccat
gctgcctttatc3′
rtpcr扩增目的片段，扩增条件：50℃逆转录30min，95℃灭活逆转录酶和预变性15min，94℃变性40s，54℃退火1min，72℃延伸2min，38个循环后72℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳，以确定反应产物大小是否为所需目的片段。
hindⅲ和xbaⅰ双酶切目的片段与pcdna3.1，回收纯化后进行dna连接反应。连接产物转化大肠杆菌dh5α，氨苄青霉素筛选阳性克隆。挑取阳性单菌落接种于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃，250r/min振摇培养至对数生长后期；提取重组质粒dna，hindⅲ和xbaⅰ酶切鉴定后，送beckmon公司测序证实。
1.4 重组质粒转染细胞以及表达产物的鉴定
将处于对数期的cos7细胞接种于细胞培养瓶和6 孔培养板，加入重组质粒pcdna3.1vr3与脂质体混合物。置co2培养箱中培养6h后，吸出培养液，加入新鲜的dmem培养液继续培养48h。
用0.25%胰酶消化cos7细胞，收集转染细胞，进行western blot分析，其中一抗为羊抗鼠vegfr3多克隆抗体，二抗为hrp标记的兔抗羊igg。使用ecl显色试剂盒，加入化学发光试剂后，显影、定影、并照相。
2 结果
2.1 重组质粒pcdna3.1vr3的构建
rtpcr扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下可见，约2 250bp处有一条特异性条带，见图1，与目的片段大小一致。
1: dna marker（dl2000）; 2: rtpcr product
图1 rtpcr 扩增产物电泳
fig 1 agarosegel electrophoresis of rtpcr product
随机挑取转化成功的单菌落，抽提质粒，进行hindⅲ和xbaⅰ酶切鉴定，电泳后可见约2 250bp的插入片段，见图2。
dna测序结果经genebank blast分析，与已报道的vegfr3胞外cdna序列相符，插入片段读框正确。
2.2 重组质粒转染cos7细胞表达产物的鉴定
重组质粒和pcdna3.1经脂质体转染真核细胞cos7， western blot检测发现， 转染重组质粒的细胞提取物有一条特异的条带， 分子量在90kd左右， 而转染空质粒的细胞提取物则没有条带， 见图3。
3 讨论
目前，抗血管生成治疗方面的研究已较深入，但单纯抗肿瘤血管生成治疗并未达到抗肿瘤转移的预期效果[3]。其原因主要是由于肿瘤生物学特性的复杂性和多态性，而且转移的发生是一个多因素、多环节参与的调控过程，仅仅阻断某一条途径并不能完全阻断肿瘤细胞远处转移。因此，抑制肿瘤淋巴道转移的研究具有非常重要的意义。
抗肿瘤淋巴管生成治疗是目前国内外治疗肿瘤的新策略。国内外研究表明，vegfr3信号转导通路在肿瘤淋巴管生成中起着重要作用。vegfr3与其配体vegfc或vegfd特异性结合，可促进淋巴管内皮细胞迁移，激活信号转导刺激淋巴管内皮细胞增殖，诱导肿瘤淋巴管生成。肿瘤淋巴管生成是促进肿瘤淋巴道转移的重要因素[45]。临床和病理研究已经证实，淋巴道转移是大多数实体肿瘤细胞播散的早期事件。肿瘤淋巴管密度 (lymphatic microvessel density, lmvd)、vegfr3等的表达与淋巴结转移、患者预后密切相关[67]。chen等[8]用rna干扰技术抑制vegfc表达，可以抑制小鼠乳腺癌淋巴道转移。上述研究结果提示，vegfr3信号转导通路主要调控肿瘤淋巴管生成。因此，针对该通路的抗体、药物及疫苗的研制成为当前肿瘤生物治疗研究的热点和方向[9]。
目前，阻断该通路的策略主要包括单克隆抗体[10]、可溶性vegfr3ig[11]、抑制剂[12]等。利用主动免疫打破对自身抗原的耐受是肿瘤治疗一个很有潜力的策略。由于dna疫苗能同时诱导体液免疫和细胞免疫，被广泛运用于感染性疾病和肿瘤免疫治疗。真核表达载体是dna疫苗的主体，其中启动子是影响dna疫苗表达效率最重要的因素。pcdna3.1具有cmv启动子，能刺激机体产生较强的免疫反应，常用于dna疫苗的构建。我们以pcdna3.1为表达载体，构建了重组质粒pcdna3.1vr3，经脂质体介导转染cos7细胞，western blot检测其蛋白表达，发现转染细胞提取物有一条特异的条带，证实重组质粒在体外真核细胞中表达的重组蛋白具备生物学活性，为后续的动物实验研究奠定基础。
本研究为进一步制备以减毒沙门氏菌为载体的vegfr3 dna疫苗奠定了基础。作为dna疫苗载体的重组减毒沙门氏菌，能通过自然感染的方式，将dna疫苗直接运送给体内的抗原递呈细胞（antigen presenting cell，apc），在黏膜和全身淋巴组织诱发以th1型应答为主的细胞免疫和体液免疫。载体菌的成分如脂多糖和 dna 疫苗上的免疫刺激序列等还可作为佐剂，增强免疫应答效果[13]。以重组减毒沙门氏菌为载体制备vegfr3 dna疫苗，可以口服给药，费用低廉，具有较好的临床应用前景。
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