【摘要】 目的 设计合成干扰端粒重复序列结合因子2(telomeric repeatbinding factor 2, trf2)基因表达的不同小型干扰rna(sirna)，筛选出能高效抑制trf2 基因表达的sirna。方法 根据人trf2 mrna的序列，设计合成3对不同的针对trf2的sirna、应用脂质体lipofectaminetm2000转染试剂将三对sirna转染人乳腺癌mcf7细胞，实时荧光定量rt－pcr技术检测trf2 mrna表达水平、western印迹法检测trf2蛋白表达以确定干扰效果。结果 设计合成的3对trf2 sirna中有2对sirna可有效抑制trf2 基因表达。结论 成功设计合成了针对trf2基因的sirna，并从中筛选出能特异且高效阻断trf2表达的sirna，为进一步应用rnai技术抗trf2基因进行肿瘤基因治疗研究奠定实验基础。
【关键词】 trf2；rna 干扰；sirna；肿瘤；基因治疗
screening of effectual sirnamediated trf2
chen shaokun, liu lan,shui qinlin, zeng yongqiu,zhao jiao
medical genetics department of luzhou medical college，luzhou 646000，china
corresponding author: shui qinlin, email: [email protected]：objective to design and synthesize small interfering rna（sirna）targeting different regions of telomeric repeatbinding factor 2(trf2) mrna，and select the sirna that can specifically and effectively suppresses trf2 expression. methods three trf2specific double stranded sirnas were designed and electroporated into mcf7 cells by lipofectaminetm2000，the transcription level of trf2 were analvzed by realtime fluorescence quantitative rtpcr and trf2 protein was tested by western blotting. results two of the three customized trf2sirnas could effectively inhibit the expression of trf2.conclusion trf2sirnas can be successfully designed and synthesized，which can specifically and effectively suppresses the expression of trf2 gene，the results of the study lay the foundation for further studying on gene therapy of tumor by rna interfere（rnai）.
key words：trf2；rnai；sirna；tumor；gene therapy
端粒(telomere)是真核细胞染色体末端的一种特化的dna－蛋白复合体。wwW.11665.cOM端粒重复序列结合因子2(telomeric repeatbinding factor 2, trf2)是一个端粒特异性结合蛋白。trf2不仅在维持端粒动态平衡、保护染色体结构稳定中起关键作用[1]，还和细胞周期调控、dna损伤修复密切相关[2]。近年来的研究还发现很多肿瘤细胞中trf2的高表达可能与肿瘤发生、细胞凋亡相关[3]，故trf2成为目前肿瘤基因治疗研究新的靶点。
rna干扰(rna interference，rnai)是目前简单而高效地阻断哺乳动物细胞内特异基因表达的最有效方法之一，可达到基因敲除效果，且安全性好。但对于rnai来说，并不是所有针对靶基因mrna序列随机设计的sirna都能引起有效的基因沉默，干扰靶序列的选择对干扰效率的影响是至关重要的。因此，对能有效抑制特异基因表达的sirna的筛选是应用rnai技术进行基因功能、基因治疗等相关研究的重要基础。
本研究采用ambion公司的网上设计软件设计三对针对trf2的sirna、经化学合成法合成、应用脂质体lipofectaminetm2000转染试剂将三对sirna转染人乳腺癌mcf7细胞、实时荧光定量rtpcr技术检测trf2 mrna表达水平、western印迹法检测trf2蛋白表达以确定干扰效果，进而筛选出trf2 sirna有效干扰序列，为应用rnai技术抗trf2基因进行肿瘤基因治疗研究奠定实验基础。
1 材料和方法
1.1 材料
人乳腺癌mcf7细胞株购自四川大学华西医院移植免疫实验室。脂质体lipofectaminetm2000、trizol reagent rna提取试剂盒购自invitrogen公司； quant sybr green rtpcr kit 购自takara公司。
1.2 靶向trf2 的sirna设计、合成
根据genbank中报道的人类trf2基因核苷酸序列（nm_005652，gi: 21536372），采用ambion公司的网上设计软件（）设计3对针对人trf2基因不同位点的sirna靶序列，另设计一对不针对任何基因的阴性对照序列（negativecontrol sirna）。四段序列经blast（http://www.ncbi.nlm. nih.gov/blast/）检索证实与其他基因无同源性，送上海吉玛制药技术有限公司化学合成，同时另合成一对fam标记阴性对照sirna。各sirna序列详见表1。
1.3 sirna转染人乳腺癌mcf7细胞
含10％新生小牛血清dmem培养基、37℃、5% co2常规培养人乳腺癌mcf7细胞。转染前一天接种指数生长期mcf7细胞于6孔板中，使细表1 sirna序列 5′acgugacacguucggagaatt3′胞数量为1.5×105/孔，每孔加入dmem培养基2ml，待细胞长到50％～70％时，参照脂质体lipofectaminetm2000（invitrogen）使用说明书进行sirna转染。首先转染fam标记阴性对照sirna并在荧光显微镜下观察转染效率，以摸索转染条件和达到最大转染效率的时间点。实验分空白组、阴性对照组、trf2603sirna组、trf2955sirna组、trf21401sirna组。
1.4 实时荧光定量rtpcr检测trf2 mrna表达
于转染后48h，收集6孔板培养的细胞，参照trizol reagent rna提取试剂盒（invitrogen）使用说明书进行细胞总rna的提取。依照实时荧光定量技术对引物的要求、设计内参gapdh荧光定量pcr引物f:5′tgggtgtgaaccacgagaa3′、r: 5′ggcatggactgtggtcatga3′，长度143bp；trf2荧光定量pcr引物f： 5′tggcccat
cctgttatccaga3′、r：5′aggcagcggactca
gatttca3′，长度134bp。按照试剂盒quant sybr green rtpcr kit说明书，在ftc2000型实时荧光定量pcr仪上进行pcr扩增，利用仪器附带的分析软件获得各样品的ct值，使用2△△ct法分析，得出待测样品的相对拷贝数；同时，pcr扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。
1.5 western blot检测trf2蛋白表达
于转染后48h裂解各组细胞提取总蛋白，bca法测定蛋白浓度。以各组总蛋白为模板，gapdh为内对照进行sdspage电泳，半干法转膜，一抗、二抗杂交孵育，最后化学发光显影并用发光成像仪取像，扫描结果用quantity one 4.4.0软件分析，检测各组trf2蛋白的相对表达量。
1.6 统计学方法
计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用spss11.0软件统计包进行方差分析并两两比较，检验水准：α=0.05。
2 结果
2.1 荧光显微镜下观察细胞转染效率
fam标记阴性对照sirna转染mcf7细胞后12h、24h、48h、72h后荧光显微镜下观察，可见转染成功的mcf7细胞内有绿色荧光，而未转染的细胞则无荧光，在同一位置经普通倒置相差显微显微镜和荧光显微镜对比观察，转染后48h转染效率最高，可达70％以上，见图1。
2.2 实时荧光定量rtpcr结果
取各组pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，均可在100与200bp之间约143bp处见内对照gapdh 基因pcr产物条带、约134bp位置见trf2基因pcr产物条带，见图2。证明引物设计合理、实验条件正确、实时荧光定量pcr扩增成功。同时，ftc2000实时荧光定量基因扩增仪在进行扩增时可以自动记录扩增动力曲线的各项数值。利用仪器附带的分析软件采用2－△△ct方法进行结果分析，获得各组样品trf2基因mrna相对拷贝数，见表2。应用spss11.0软件统计包对多样本均数进行两两比较的q检验方差分析，结果：(1) trf21401sirna组、trf2955sirna组trf2 mrna相对拷贝数明显低于空白组、阴性对照组和trf2603sirna组(p＜0.05)；(2) 空白组、阴性对照组和trf2603sirna组彼此之间差异无统计学意义(p＞0.05)；(3) trf21401sirna组、trf2955sirna组间差异无统计学意义(p＞0.05)。说明trf21401sirna、trf2955sirna可以有效抑制trf2 mrna的表达。
2.3 western blot结果
免疫印迹法杂交显影显示，见图3。5条泳道均在67kda和37kda处各出现一条带，与预期的内对照gapdh和trf2蛋白产物相吻合，说明两者均为特异性蛋白条带。其中各组gapdh条带的亮度相似，而trf2条带的亮度trf21401sirna组、trf2955sirna组明显弱于其他三组。表2 trf2 mrna相对拷贝数
3 讨论
trf2是一个端粒特异性结合蛋白，主要负责保护染色体的末端，trf2丢失将会导致染色体末端失去保护，造成端粒3′末端丢失和染色体端－端融合，同时端粒失去了trf2的保护会被当作dna损伤位点而引发细胞内的dna损伤响应系统，诱导细胞凋亡。此外，很多肿瘤细胞中trf2的高表达可能与肿瘤发生、细胞凋亡相关。marcia等[4] 发现在成人淋巴细胞白血病中trf2高表达，而在无症状携带者和正常人中低表达。raquel等[5]发现trf2在皮肤癌的形成过程中扮演着潜在的致癌基因的作用。nijjar等[6]比较人乳腺表皮hmec细胞及临床乳腺癌衍生细胞系的trf2蛋白水平，15株乳腺癌细胞株中，11株比对照组正常细胞高2倍，表明trf2上调在体内乳腺癌癌性转化过程中是个高发事件。张杨等[7]通过分析三氧化二砷(as2o3)对人胃癌mgc803细胞端粒重复序列结合因子1．2(trf1、trf2)表达及端粒稳定性的影响,发现as2o3通过下凋trf2蛋白表达使染色体端端融合，从而诱导mgc803细胞凋亡。故可通过抑制肿瘤细胞中trf2基因的表达、诱导肿瘤细胞凋亡从而达到肿瘤基因治疗的目的。
尽管rnai提供了一种经济、快捷、高效的抑制特异基因表达的技术手段，是研究基因功能的重要工具，并且逐步成为病毒性疾病、遗传性疾病以及肿瘤等基因治疗研究的一种重要手段。但随着研究的深入，人们发现并不是所有针对靶基因mrna序列随机设计的sirna都能引起有效的基因沉默，干扰靶序列的选择对干扰效率的影响是至关重要的。早在2002年，elbashire[8]和holen[9]就分别提出过sirna的有效性高度依赖于靶点位置的观点。song等[10]针对小鼠凋亡受体fas基因设计了6段sirna，其中只有3段有效。yoshinari等[11]的研究也发现，即使sirna的序列起始位置只错后1个或2个碱基，其抑制效果也大大降低。gilad等[12]的实验也证实了这种观点。因此，对于rnai来说，能有效抑制特异基因表达的sirna的筛选是进行基因功能等相关研究的重要基础。本研究针对人trf2基因设计的3对sirna，通过实时荧光定量rtpcr及western blotting检测证实有2对能有效抑制目的基因的表达，成功筛选出能有效抑制trf2基因表达的sirna,为应用rnai技术抗trf2基因进行肿瘤基因治疗研究奠定了实验基础。
【参考文献】
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［编辑：刘红武；校对： 马福元］doi:10.3971/j.issn.10008578.2009.01.014
