【摘要】 目的探讨cxcr4/cxcl12在胃癌组织中表达及其在肝转移中的作用。方法应用western blot 检测40例胃癌患者标本中肿瘤组织、邻近正常黏膜以及肝转移组织中cxcr4/cxcl12通路成员的表达情况，免疫组织化学法检测cxcr4/cxcl12在细胞水平的分布。结果胃癌组织中cxcr4/cxcl12表达水平明显增高（肿瘤组织vs正常黏膜,p<0.05）；10例肝转移组织中cxcr4/cxcl12表达增高（转移组织vs原发肿瘤,p<0.05）；cxcr4/cxcl12表达水平与tnm 分期晚（ⅲ/ⅳ）有关（p<0.05）。结论cxcr4/cxcl12信号转导通路可能在胃癌肝转移过程中起一定作用，详细机制尚待进一步研究。
【关键词】 胃癌；信号转导；趋化因子；转移
expression and clinical significance of cxcr4/cxcl12 in gastric carcinoma
ma xiangtao1,yu liwei1,fu jing2
department of surgery, department of pathology, beijing haidian hospital, beijing 100080,chinaabstract：objective to investigate the expression of cxcr4/cxcl12 and its potential role in hepatic metastasis of gastric carcinoma.methodsgastric cancer tissue, adjacent normal tissue and hepatic metastatic tissue samples were collected from 40 gastric carcinoma patients. several cxcr4/cxcl12 pathwayrelated proteins (cxcr4,cxcl12,cyclin d1 and bclxl)expression were detected by western blot. correlations between cxcr4/cxcl12 expression and clinicopathological parameters in gastric carcinoma were analyzed. cxcr4 and cxcl12 expression in cell level were determined using immunohistochemistry method.resultsthe expression of cxcr4 and cxcl12 protein significantly increased in gastric cancer compared to adjacent normal mucosa (p<0.05), it was also highly expressed in metastatic tissue versus primary tumor tissue (p<0.05) our data showed that expression of cxcr4 and cxcl12 protein are correlated with tnm colorectal cancer staging(p<0.05).conclusioncxcr4/cxcl12 overexpressed in both primary and metastatic tissue of gastric carcinoma. it is implied from our results that cxcr4/cxcl12 signaling pathway plays an important role in hepatic metastasis of gastric cancer.
key words：gastric neoplasm; signal transduction; chemokine; metastasis
1材料与方法
1.1材料 western blot中用的pvdf膜购自millipore公司，显影用的胶片购自柯达公司。www.11665.COm本研究中所有抗体购自santa cruz公司。预染标准分子量蛋白购自gibco/brl公司。ecl化学发光试剂盒来自amersham公司。浓缩蛋白分析液来自biorad公司。研究中所涉及的其他试剂均为分子生物学纯度，购自sigma公司或amresco公司。
1.2患者资料与组织标本收集北京海淀医院外科2003年12月~2005年12月经手术切除的胃癌标本40例，于手术切除后15~20min内采集胃癌组织及癌旁肠黏膜组织作为对照（距肿瘤边缘大于5cm），以及肝转移组织（病理证实），立即置于液氮中保存。患者在手术前未接受化疗或者放疗并且签署知情同意书。临床病理资料详见表1。肿瘤分期按照美国癌症联合委员会（ajcc）的tnm分期[3]。表1cxcr4/cxcl12表达与胃癌临床病理特征的关系(
1.3研究方法
1.3.1组织蛋白提取组织于裂解缓冲液中裂解（150mm 氯化钠; 1% 过氧胆酸钠; 1% triniton x100; 0.1%十二烷基磺酸钠; 10mm tris,ph 7.2; 1mm 正钒酸钠; 1mm苯甲磺酰氟; 1mm 氟化钠; 0.1mm抑肽酶,1mm亮抑蛋白酶肽）。裂解液在4℃ 条件下13000r/min,离心30min。
1.3.2蛋白浓度测定方法（bradford法）以牛血清蛋白（bsa）作为标准品，根据蛋白定量试剂盒（美国biorad公司）说明绘制蛋白定量标准曲线，于分光光度计595nm下测光密度值，计算提取液蛋白浓度。
1.3.3western blot[4]在进行western blot之前将蛋白提取物与2×十二烷基磺酸钠 (sds) 上样缓冲液按1∶1混合 (125mm tris·hcl,ph 6.8; 4%十二烷基磺酸钠; 20%甘油; 10% 2巯基乙醇) 后100℃水浴下加热5min。取总蛋白50μg，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后电转移到pvdf膜上。电泳时在聚丙烯酰胺凝胶中加入预染标准分子量蛋白作为指示 。转膜后用tbst缓冲液(10mm tris,hcl，ph 7.5，150mm 氯化钠，0.5% tween20)与5% 牛血清白蛋白封闭30min 。封闭后，加入一抗cxcr4、cxcl12、cyclin d1与bclxl，工作浓度1∶1000，gapdh 作为内参照，于4℃条件下孵育过夜，用tbst（每次5min）洗膜后，与辣根过氧化物酶结合的二抗孵育30min，工作浓度1∶1000。然后用ecl化学发光试剂盒检测杂交信号。用phospho imager图像分析仪（美国molecular dynamics公司）测定条带的吸光度（a值），以a值代表蛋白的相对表达量。
1.3.4免疫组织化学法组织标本在4%的福尔马林中固定，用石蜡包埋。胃癌与正常黏膜组织切成厚5μm，附着于载玻片上，在空气中干燥，然后在60℃烤箱中加热2h。切片于二甲苯中脱腊后经梯度乙醇水化，用0.3%的过氧化氢甲醇溶液抑制内源性过氧化物酶。然后进行抗原修复：切片在10mm枸橼酸缓冲液(ph 6.0)中加热10min后，用pbs (ph 7.4)缓冲液清洗并使切片冷却，然后将切片与5%的血清在湿盒内室温下孵育30min阻断非特异结合位点。切片在4℃条件下与一抗cxcr4孵育过夜，稀释比1∶75。dab显色，苏木素复染，阴性对照中用tbs替换一抗。
1.4统计学方法统计学分析用spss 12.0软件完成，p<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1cxcr4通路各成员在胃癌组织中的表达情况cxcr4、cxcl12、cyclin d1与bclxl在胃癌组织中表达明显升高（p<0.05）。cxcr4与cxcl12在肝转移组织中表达高于原发肿瘤，但无统计学意义，可能与标本量较少有关，见图1~4。
2.2cxcr4与cxcl12表达水平与各临床病理特征的关系cxcr4与cxcl12表达与tnm分期较晚有关。ⅲ+ⅳ胃癌组织中cxcr4与cxcl12表达明显高于ⅰ+ⅱ胃癌，p值分别为0.036与0.031（p<0.05）。cxcr4与cxcl12表达与患者性别、年龄、肿瘤分化、远处转移、肿瘤大小无关，见表1。
2.3cxcr4与cxcl12表达相关性分析经pearson相关性分析显示cxcr4与cxcl12在胃癌组织中表达情况呈线性相关，r=0.463，p<0.05。 gapdh represents the internal protein control.elevated levels of cxcr4,cxcl12,cyclin d1,and bclxl in tumor (t) tissues were compared to adjacent normal mucosae (n);gapdh represents the internal protein control.elevated levels of cxcr4 and cxcl12 in tumor (t) tissues and liver metastasis (l) were compared to adjacent normal mucosae (n)
图1cxcr4、cxcl12、cyclin d1与bclxl在胃癌组织中的表达图2cxcr4、cxcl12在胃癌肝转移组织中的表达图3胃癌组织中cxcr4染色阳性（×200）图4胃癌组织中cxcl12染色阳性（×200）
fig 1expressions of cxcr4,cxcl12,cyclin d1,and bclxl in gastric carcinomafig 2expressions of cxcr4 and cxcl12 in liver metastasis gastric carcinomafig 3positive staining of cxcr4 in gastric carcinoma (×200)fig 4positive staining of cxcl12 in gastric carcinoma (×200)3讨论趋化因子（chemokines）是一类最早发现与免疫细胞具有控制细胞向炎症定向迁移的细胞因子[1]。目前已经发现几十种趋化因子，根据半胱氨酸残基位置不同，趋化因子分为4个亚族：c、cc、cxc与cx3c，相应的受体称为xcr、ccr、cxcr与cx3c。肿瘤细胞在生长过程中能够自主分泌多种趋化因子并且表达其受体，进而刺激肿瘤细胞生长。某些趋化因子不仅可以直接刺激肿瘤细胞生长，还可以通过促进血管新生而间接促进肿瘤生长[56]。研究表明cxcr4及其配体cxcl12与肿瘤转移关系密切[7]。kato等[8]对79 例手术切除的乳腺浸润性导管癌组织进行的研究表明，所有患者癌组织均表达cxcr4，其中高表达尤其是局灶性高表达者伴有广泛淋巴结转移，cxcr4可能在乳腺癌淋巴转移中起促进作用。研究发现乳腺癌细胞中cxcr4表达异常增高，应用cxcr4抑制剂可以明显下调乳腺癌细胞中cxcr4表达，抑制动物模型中乳腺癌转移发生[9]。使用cxcr4 拮抗剂t140或通过rna干扰技术抑制cxcr4 基因均可抑制乳腺癌细胞在体外的迁移反应[10]。目前关于胃癌中趋化因子cxcr4表达及其在转移中的作用尚不清楚。本研究发现cxcr4/cxcl12在胃癌组织中高表达，正常黏膜cxcr4/cxcl12呈低表达，cxcr4在肝转移组织中高于原发肿瘤（10/10）。可能的机制为肝细胞选择性高表达cxcl12与高表达cxcr4肿瘤细胞结合[11]。研究显示趋化因子家族影响着肿瘤的生长、浸润、远处转移。检测胃癌细胞趋化因子受体cxcr4成员有助于判断患者转移或者复发，这将完善胃癌分子生物学分期系统，并且有助于筛选治疗胃癌的靶基因。
【参考文献】
［1］bendall l.chemokines and their receptors in disease[j].histol histopathol,2005,20(3):907926.
［２］tanaka t,bai z,srinoulprasert y,et al.chemokine receptors in cancer metastasis and cancer cellderived chemokines in host immune response[j].cancer sci,2007,98(11):16521658.
［３］greene fl,page dl,fleming id,et al,editors.american joint committee on cancer staging manual［m］.6th edition.philadelphia: springer.2002:9198.
［４］马向涛,余力伟,王杉,等.stat3信号转导通路调控caspase3表达促进结肠癌细胞凋亡的机制[j].肿瘤防治研究,2006,33(11):808810.
［５］马向涛,余力伟,王杉,等.结直肠癌淋巴结转移与趋化因子受体cxcr4/cxcl12信号转导通路的关系[j].中华实验外科杂志,2007,24(1):6061.
［６］马向涛,余力伟,付静.趋化因子受体ccr6/ccl20在结直肠癌肝转移中的作用[j].中华实验外科杂志,2007,24(8):910912.
［７］singh s,sadanandam a,singh rk.chemokines in tumor angiogenesis and metastasis[j].cancer metastasis rev,2007,26(34):453467.
［８］kato m,kitayama j,kazama s,et al.expression pattern of cxc chemokine receptor4 is correlated with lymph node metastasis in human invasive ductal carcinoma[j].breast cancer res,2003,5(5):144150.
［９］ruffini pa,morandi p,cabioglu n,et al.manipulating the chemokinechemokine receptor network to treat cancer[j].cancer,2007,109(12):23922404.
［10］arya m,ahmed h,silhi n,et al.clinical importance and therapeutic implications of the pivotal cxcl12cxcr4 (chemokine ligandreceptor) interaction in cancer cell migration[j].tumour biol,2007,28(3):123131.
［11］ishigami s,natsugoe s,okumura h,et al.clinical implication of cxcl12 expression in gastric cancer[j].ann surg oncol,2007,14(11):31543158.
