作者：潘思年 张成喜 李燕虹 马华梅 朱顺叶 杜敏联
【摘要】 【目的】 研究生长激素(gh)对性激素抑制下的离体青春期大鼠生长板软骨细胞表皮生长因子(egf)mrna表达及其蛋白合成、分泌的影响。【方法】 3周龄雌性sd大鼠开始注射促性腺激素释放激素拟似物(gnrha)至7周龄，随后分离培养5 ～ 8只大鼠胫骨生长板原代软骨细胞，分为时效组和量效组。采用四氮甲基唑蓝(mtt)以及免疫组化法测定增殖细胞核抗原(pcna)，观察不同剂量、不同干预时间的生长激素对性激素抑制下的离体青春期大鼠生长板软骨细胞增殖的影响。用rt-pcr法检测软骨细胞egf mrna的表达，酶联免疫吸附法(elisa)测定egf的表达。【结果】 生长激素以时效和量效作用方式对雌激素受抑的离体青春期大鼠生长板软骨细胞增殖呈双相型影响。gh作用6 h后软骨细胞的egf mrna表达显著增加(与0 h比较p < 0.05)，且从6 h到24 h间存在明显的时间依赖性(组间p < 0.05)，在18 h达到最高峰。gh作用12 h后软骨细胞分泌入培养基中的的egf表达显著增加(与0 h比较p < 0.05)，且从12 h到48 h间存在明显的时间依赖性(组间p < 0.05)，在36 h达到最高峰。量效关系显示50 ng/ml浓度的gh开始能显著增加培养基中egf mrna和蛋白的表达，且从50 ng/ml至1 000 ng/ml间存在明显的浓度依赖性(组间p < 0.05)，在100 ng/ml时表达达到最高峰。Www.11665.coM【结论】 生长激素能促进性激素抑制下的离体青春期大鼠生长板软骨细胞的增殖及egf mrna和蛋白的表达。
【关键词】 软骨细胞; 细胞培养; 生长板; 生长激素; 表皮生长因子
abstract： 【objective】 to investigate whether growth hormone could up-regulate local epidermal growth factor (egf) synthesis (egf peptide and egf mrna levels) in cultured growth plate chondrocytes. 【methods】 at 3 week of age， sprague-dawley rats received 2.5 mg/kg in slow-released gnrha (triptorelin) which was repeated every 2 weeks for 2 times till 7-week old. chondrocytes from tibial growth plate of 5 ～ 8 sprague-dawley rats by trypsin-collagenase digestion were cultured in monolayer. primary chondrocytes were divided into time?鄄effect groups and concentration-effect groups. mtt and immunohistochemical staining of proliferating cell nuclear antigen (pcna) were conducted to observe the effect of gh on the proliferation of chondrocytes. rt-pcr and elisa method were conducted to detect egf expression in mrna level and protein level respectively. 【results】 gh enhanced the proliferation of the chondrocytes in time-course-dependent and concentration-dependent manner. incubation with gh 100 ng/ml maximally increased expression levels of egf mrna (for 18 h) and egf peptide (for 36 h) respectively， compared to the control group. the expression levels of egf mrna and egf peptide by gh-stimulated synthesis was dose-dependently， maximally stimulatory concentrations of gh was 100 ng/ml. 【conclusion】 gh enhances the proliferation of chondrocytes of pubertal 中枢性性早熟(central precocious puberty， cpp)是儿科内分泌的常见疾病之一，cpp患儿因性激素提前分泌增多引起骨骼成熟的加速，最终导致成年矮身材。促性腺激素释放激素类似物(gonadotrophin releasing hormone analogues，gnrha)是当前治疗cpp的主要药物[1]。它能有效抑制性激素的分泌而延缓骨龄增长，但同时部分患儿可发生生长过度减速，而成为影响疗效的症结。因此，探讨减速的机制并以此寻求有效克服gnrha所致生长减速成为目前的研究热点。目前基因重组生长激素(recombinant human growth hormone， rhgh)与gnrha联用被证实能克服生长减速，改善成年终身高[2]。现已明确，gnrha治疗中gh?鄄igf-1轴无可确定的改变，况且所发现的可能有的改变又与生长速度无直接关系[3]。可见，gnrha与gh联用虽能克服减速，但其促生长的机制尚不清楚，故有必要深入探讨gnrha致生长减速时联用gh促生长的机制，为寻找新的治疗靶点，并为进一步寻求gh以外的克服减速的途径提供理论依据。长骨的生长是由众多内分泌激素和生长因子调控的[4]，gh在对抗gnrha所致的生长减速时是否有生长板上其它生长因子的协同参与是本文的研究目的。近年来，表皮生长因子(epidermal growth factor， egf)在长骨生长中所起的作用日益受到关注[5]，基因敲除动物实验显示，表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor， egfr)缺失的小鼠存在生长发育的障碍[6]。为了考察egfr通路是否参与了gh促进gnrha处理后青春期大鼠的生长;我们用来自经gnrha处理后青春期大鼠胫骨生长板的体外培养的原代软骨细胞，以gh处理，观察gh能否上调软骨细胞egf的分泌。
1 材料与方法
1.1 实验动物
3周龄雌性sd大鼠开始肌内注射gnrha 曲普瑞林 (达菲林，diphereline，法国博福-益普生制药有限公司)，每2 周一次，共2 次，7 周时处死大鼠[7]。
1.2 主要试剂
重组人生长激素(rhgh，为cytolab/peprotech asia产品);无酚红dmem/f12(1：1)培养基(sigma公司);炭吸附的胎牛血清(charcoal stripped fetal bovine serum csfbs， hyclone);胰蛋白酶(1：250，amresco);ⅱ型胶原酶(invitrogen);氮兰四唑盐(mtt， sigma公司);二甲基亚砜(dmso，sigma公司);sp和dab显色试剂盒(福州迈新);小鼠抗大鼠增殖细胞核抗原pcna单克隆抗体(cell signaling);trizol试剂(invitrogen 公司);逆转录试剂盒和taq酶(toyobo公司);大鼠egf elisa试剂盒(美国rapidbio lab)。
1.3 实验方法与步骤
1.3.1 原代软骨细胞的分离与培养
按照本实验室所建立的方法[8]。7 周时处死大鼠，无菌取出胫骨生长板软骨，按两步酶消化法获得原代软骨细胞，加入含10%炭吸附的胎牛血清的无酚红dmem/f12(1：1)培养基中，在37 ℃，体积分数5%co2，95%饱和湿度培养箱中培养。
1.3.2 分组
将5 ～ 8只雌鼠的原代软骨细胞根据gh的作用分为时效组和量效组。时效组为gh作用后1 d， 2 d， 3 d， 4 d， 5 d， 6 d， 7 d(gh浓度为100 ng/ml)，同时每天设立无药对照组作为同步对照;量效组分为8组：对照组、10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、500 ng/ml、1 000 ng/ml浓度gh干预组，各干预4 d。
1.3.3 mtt比色法测定生长激素对体外培养的软骨细胞增殖的影响
原代软骨细胞按每孔1 × 104个细胞的密度接种于96孔培养板，每组6复孔。加gh后，时效组每天收取1块96孔板进行显色，共7 d;量效组于gh作用后4 d取出，进行显色，每孔加入mtt(5 g/l) 20 μl并继续孵育4 h后弃培养基，加dmso 150 μl/孔，置酶标仪上测定490 nm波长处吸光度值(a)。
1.3.4 免疫组化检测增殖核抗原的表达
采用细胞爬片技术，原代软骨细胞按每孔20 × 104个细胞的密度接种于24孔培养板，gh处理流程同mtt法。按标准sp检测试剂盒说明书进行免疫组化。增殖核抗原(proliferating cell nuclear antigen，pcna)抗体浓度为1：4 000，以胞核染为棕黄色为阳性细胞，计算阳性率，取平均值后为该细胞爬片的pcna表达半定量值。
1.3.5 rt-pcr测软骨细胞egf mrna的表达
①gh对培养软骨细胞的干预： 按3 × 105个细胞/皿的密度将原代软骨细胞悬液接种于35 mm的培养皿中。时效组(gh作用浓度为100 ng/ml)分为0 h、6 h、12 h、18 h、24 h、36 h共6个时间点。量效组分为对照组、10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、500 ng/ml、1 000 ng/ml浓度gh干预组，各干预18 h。②rt-pcr测软骨细胞egf mrna的表达： egf引物序列为：上游引物5′-gacaactcccctaaggctta-3′，下游引物5′-catgcacacgccaccatt-3′，扩增片段长度为567 bp;内参照β-actin基因引物序列为：上游引物5′-agccatgtacgtagccatcc-3′，下游引物5′-gtggtggtgaagctgtagc-3′，扩增片段长度为219 bp。反转录反应条件：42 ℃ 60 min，99 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min， pcr反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，循环30次，72 ℃延伸10 min，4 ℃结束。将pcr扩增产物进行电泳。采用gene genius凝胶成像分析系统及配套软件测定电泳条带灰度。
1.3.6 elisa法测定培养液中egf蛋白含量
按3 × 105个细胞/皿的密度将原代软骨细胞悬液接种于35 mm的培养皿中。时效组(gh作用浓度为100 ng/ml)分为0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h共6个时间点。量效组分组同前，各干预36 h。gh干预后收集细胞培养上清液，采用截留分子质量为6 ku的超滤离心管浓缩上清，按试剂盒说明书检测上清液中egf的浓度。
1.4 统计学分析
实验数据用均数 ± 标准差表示。统计分析采用spss 13.0统计软件，组间比较采用单因素方差分析(anova)，各组两两之间的比较采用lsd法。时效组中同日干预组与对照组间均数比较用t检验，p < 0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 mtt法检测gh对体外培养的软骨细胞增殖的影响
gh在体外能促进软骨细胞增殖并存在时效关系，作用后1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d组与对照组比较有统计学意义(p < 0.05)，以第4天时的促增殖效应最强。随着时间的延长，第5天开始gh的促增殖效应渐减弱，至第7天时，与第4天比较差异有统计学意义(p < 0.01，表1)。gh在体外促进软骨细胞增殖的效应亦存在一定的量效关系。低浓度gh(10 ng/ml、20 ng/ml)与对照组比较无统计学意义(p > 0.05)，促增殖效应不明显。增加浓度至50 ng/ml时促增殖效应就显现(p < 0.05)，至100 ng/ml时促增殖效应最明显，当gh浓度进一步加大时，促增殖效应又开始减弱，至1 000 ng/ml时与100 ng/ml相比有统计学意义(p < 0.05，表2)。
2.2 pcna免疫组化染色结果
免疫组化结果显示gh作用1、2、3、4、5、6 d组pcna的表达与对照组相比有统计学意义(p < 0.05)，pcna在第4天时表达最强。随着时间的延长，第5天开始pcna的表达逐渐减弱，至第7天时，与第4天比较差异有统计学意义(p < 0.05，表1、图1)。量效关系显示当gh浓度低时(10 ng/ml、20 ng/ml)pcna的表达与对照组比较无差异(p > 0.05)。而浓度增加至50 ng/ml时pcna的表达增强(p < 0.05)，至100 ng/ml时表达最强，再进一步加大gh浓度时，表达又开始逐步减弱，至1 000 ng/ml时与100 ng/ml比较有统计学意义(p < 0.05，表2、图1)。
2.3 gh对软骨细胞egf mrna的表达的影响
gnrha处理后青春期大鼠原代的生长板软骨细胞在含相同浓度(100 ng/ml)的培养基中培养，各个时间点rt-pcr测定软骨细胞的egf mrna的表达结果显示，gh作用6 h后软骨细胞的egf mrna表达显著增加(与0 h比较p < 0.05)，且从6 h到24 h存在明显的时间依赖性(组间p < 0.05)，在18 h达到最高峰，之后随gh作用时间进一步延长，egf mrna的表达不再增加，反而有明显下降(24 h、36 h与18 h比较p均 < 0.05)。量效关系显示软骨细胞在含不同浓度gh的培养基中培养18 h后，50 ng/ml浓度的gh开始能显著增加软骨细胞的egf mrna的表达，且从50 ng/ml至1 000 ng/ml间存在明显的浓度依赖性(组间p < 0.05)，在100 ng/ml时表达达到最高峰，之后随gh浓度进一步增加，egf mrna的表达不再增加反而下降，与100 ng/ml比较p < 0.05，但至1 000 ng/ml时仍高于对照组，差异有统计学意义(图2、图3)。
2.4 gh对软骨细胞egf的表达的影响
gnrha处理后青春期大鼠原代的生长板软骨细胞在含相同浓度(100 ng/ml)的培养基中培养，并于各个时间点留取细胞培养上清液，浓缩后测定浓度结果显示，gh作用12 h后软骨细胞分泌入培养基中的的egf 表达显著增加(与0 h比较p < 0.05)，且从12 h到48 h间存在明显的时间依赖性(组间p < 0.05)，在36 h达到最高峰，之后随gh作用时间进一步延长，egf的表达不再增加，反而有明显下降，至60 h回落至刺激前水平，与48 h、36 h比较，差异有统计学意义(p均 < 0.05)，60 h与刺激前差异无统计学意义(p > 0.05)。量效关系显示软骨细胞在含不同浓度gh的培养基中培养36 h后，50 ng/ml浓度的gh开始能显著增加培养基中egf的表达，且从50 ng/ml至1 000 ng/ml间存在明显的浓度依赖性(组间p < 0.05)，在100 ng/ml时表达达到最高峰，之后随gh浓度进一步增加，egf的表达不再增加反而下降，与100 ng/ml比较p < 0.05，但至1 000 ng/ml时仍高于对照组，差异有统计学意义(p < 0.05，图4)。
3 讨 论
细胞增殖是指细胞进行细胞核与细胞质的复制，继而发生有丝分裂，细胞数量得以增加。本实验从mtt比色试验以及pcna免疫组化两方面的实验均证实gh能促进体外培养软骨细胞的增殖，而且也存在时间，剂量的依赖性。gh刺激骨、软骨细胞的生长和分化主要有两个假说：①生长介素理论，间接途径[9]，即gh刺激肝细胞等产生生长介素-胰岛素样生长因子1(igf-1)，igf-1起作用;②直接途径[10]，gh直接作用于靶细胞上的gh受体(ghr)而产生生理效应。经典理论认为，gh对长骨的促生长作用主要由间接途径介导的，而直接途径相对较弱。我们以往在大鼠的在体的研究结果显示，在gnrha所致性腺抑制情况下，外源性gh虽能促进雌鼠的体格(体质量、体长、胫骨长)生长，促进生长板软骨细胞的增殖和肥大从而促进长骨生长，但其促生长效应既不依赖于循环gh/igf-1轴功能，也无生长板局部的igf-1/igf-1r的改变。可见，gh促进对gnrha所致性激素抑制大鼠的生长并不直接经gh-igf-1轴介导。已明确的研究结果显示，gh直接促进细胞分化的作用在长骨生长中只占1/5[11]，因此用ghr的直接介导作用并不能完全解释其促进生长板生长的作用。鉴于生长板软骨细胞的分化和生长发育是由包括了gh在内的众多的细胞因子共同调控的，因此有必要对它们之间的相互作用进行探讨。tajima等[12]观察了正常大鼠、垂体切除大鼠以及垂体切除大鼠用gh治疗后胫骨生长板egf的表达情况，发现egf主要分布于正常大鼠生长板的增殖区，垂体切除后egf表达明显减少，生长板的宽度亦减少，使用gh治疗后，生长板的宽度增加并且生长板各区均见egf的表达，说明gh能经影响egf的表达促进生长。但对于在性激素抑制的情况下，gh在生长板水平对egf的影响，国内外尚无相关研究。本研究的结果显示，在性激素抑制的情况下，gh能促进软骨细胞增殖并以量效和时效的方式上调egf mrna的表达及其蛋白的合成和分泌;量效作用更显著。此结果提示，gh有可能经直接或间接的作用方式影响软骨细胞，gh促增殖效应可能部分与egf的参与和介导有关。
egf 是一种由53个氨基酸残基组成，分子质量为6 045 u的多肽，对多种细胞具有促增殖作用。egf是通过与其特异性的靶细胞表面受体(egfr)结合而实现其生物学功能的。传统观点认为egf不参与软骨细胞增殖与分化的调控，也鲜有egf对生长板软骨细胞增殖分化研究的报道。目前有的证据提示egf与软骨细胞增殖分化的调节有关：首先，生长板软骨中有egf的表达，并且主要分布于增殖区，同时在软骨细胞表面检测到egf的高亲和力和低亲和力受体[13];其次，在高密度培养的人关节软骨细胞中也检测到egf的表达，提示软骨细胞具有egf自分泌的功能;此外，egf能直接促进体外培养的软骨细胞的增殖[14];再者，egf能增加生长板软骨细胞表面的igf-1受体以增强软骨细胞对igf-1的反应，从而间接地促进软骨细胞的增殖[15]。因此，在性激素抑制的情况下，gh能上调软骨细胞egf的表达，两者进而协同促进软骨细胞的生长。由于egf促进软骨细胞的增殖还是需通过与其自身的egfr被激活，引起受体后信号传递实现。因此，有必要探讨gh-egf-细胞增殖间的关系;gh如何上调生长板局部软骨细胞egf的表达，是否还涉及gh-egf受体后信号的交联等相关机制尚待进一步的研究。
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