作者：臧颖 何昕华 庞瑞萍 魏绪红 信文君 周利君 李永勇 刘先国
【摘要】 【目的】 探讨肿瘤坏死因子α(tnf-α)对背根神经节(drg)电压门控性钠通道(nav1.3)表达的影响，并探讨其在神经病理性疼痛形成中的可能作用。【方法】 采用免疫荧光组织化学方法和免疫荧光细胞化学方法，观察外源性重组tnf(rrtnf)对在体大鼠和离体培养的大鼠drg神经元nav1.3表达的影响。【结果】 ①不损伤任何神经，仅在大鼠坐骨神经周围给予100 pg/ml 的rrtnf可引起病理性疼痛的产生，并引起l5和l4 drg神经元内nav1.3显著上调;②在分离培养的正常成年大鼠drg神经元表面直接给予100 pg/ml rrtnf显著诱导nav1.3表达上调，其上调分布于drg神经元的胞膜和胞浆，并以胞膜上调更为显著。【结论】 tnf-α在神经病理性疼痛形成中具有重要作用，外周神经损伤可能通过drg内tnf-α的上调，促发nav1.3异常表达，由初级感觉传入异常兴奋，参与病理性疼痛的产生。
【关键词】 肿瘤坏死因子-α; 钠通道; 背根神经节; 病理性疼痛
abstract： 【objective】 to discuss the effect of tnf-α on the expression of tetraodontoxin-sensitive nav1.3 channels in dorsal root ganglion (drg) and further to explain the mechanism resided in the development of neuropathic pain. 【method】 with use of the methods of immunohistochemistry and immunocytochemistry， the effect of recombinant rat tnf-α (rrtnf) on the expression of nav1.3 in drg neurons was investigated in vivo and in vitro. 【result】 peri-sciatic administration of rrtnf without any nerve injury， which produced lasting mechanical allodynia， up-regulated nav1.3 in l4 and l5 drg neurons in vivo. rrtnf at the concentrations of 100 pg/ml increased the expression of nav1.3 in cultured adult rat drg neurons. the disposition of nav1.3 is located in cytoplasm and membrane， especially in membrane. 【conclusion】 these data suggested that increased tnf-α in drg neurons may contribute to neuropathic pain by induction of the over-expression of nav1.3 channels.
长期以来，人们一直认为胶质细胞的功能仅仅是对神经元起支持和营养作用。WWW.11665.cOm近年来的大量研究表明，神经损伤可激活神经胶质细胞(主要是星形胶质细胞和小胶质细胞)，使其合成和分泌致炎细胞因子，参与神经病理性疼痛的产生和维持[1]。在众多的致炎细胞因子中，肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha， tnf-α)起核心作用。行为学研究指出，肌肉内、皮下、神经内或鞘内注射tnf-α可引起痛觉过敏，而阻断tnf-α受体可减轻神经病理性疼痛[1-2];tnf-α-/-基因缺陷小鼠在不能合成tnf-α的情况下，由神经损伤引起的痛觉过敏显著减轻[3]。我们的近期研究还发现，腰5脊神经前根切断(切断运动神经，lumbar 5 ventral root transection， l5-vrt)的病理性疼痛大鼠，其背根神经节(dorsal root ganglion， drg)神经元和双侧脊髓背角tnf-α及其ⅰ型受体持续上调，抑制tnf-α的合成可显著抑制病理性疼痛[4];在不损伤外周神经的情况下，坐骨神经周围施以微量的重组tnf(peri-sciatic administration of recombinant rat tnf-α， pst模型)可通过激发tnf-α的自分泌过程引起drg神经元tnf-α持续上调和机械痛超敏[5]。以上结果表明，初级感觉传入(drg)上tnf-α的上调在病理性疼痛形成中具有重要作用。因此，确定tnf-α的致痛敏机制可以为临床镇痛药物的开发提供重要的理论线索。尽管以上结果并未详尽阐明tnf-α的致痛敏机制，但可以推测tnf-α是通过某种途径最终引起初级传入异常兴奋，诱发病理性疼痛产生的。研究已表明，电压门控性钠通道的跨膜内向电流是决定神经元动作电位产生和扩布的重要因素，它的结构或功能改变可直接调控中枢和外周神经系统神经元的兴奋性，其中脑ⅲ型钠通道(nav1.3)的上调可能是神经损伤后drg神经元高兴奋性的主导因素[6]，tnf-α是否通过引起电压门控钠通道(nav1.3)的表达改变进而诱发痛过敏值得深入研究。本研究拟用在体动物模型-pst模型和离体培养的drg神经元，观察给予外源性重组tnf(recombinant rat tnf-α， rrtnf)对drg内nav1.3表达的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物
实验动物采用成年雄性sd大鼠，体质量150 ～ 200 g，随机分为假手术组(n = 5)、pst模型组(n = 6)和细胞培养实验用组(n = 5)。动物由中山大学北校区实验动物中心提供，分笼饲养，室温及室内相对湿度分别维持在(22 ± 1)℃和(65 ± 5)%，按照大鼠的生物节律将光照时间维持在每日的7：00 am-7：00 pm。为尽量减轻动物在实验中的痛苦，所有实验步骤均按照实验动物的相关使用原则操作。
1.2 慢性坐骨神经周围给予rrtnf模型(pst model)
此模型是在大鼠清醒状态下，通过导管在其坐骨神经周围反复多次给予rrtnf得以实现。如图1所示，大鼠在4 g/l 戊巴比妥钠 (40 mg/kg) 腹腔注射麻醉下，左后肢背侧经备皮、消毒后，沿坐骨神经走行方向做一斜向中线的斜行切口，用玻璃分针小心分离出后肢中段水平的坐骨神经，将一端连有pe-10导管(6 cm)的无菌明胶海绵(15 mm × 5 mm × 9 mm) 包裹于已分离出来的坐骨神经周围，并将导管固定于周围肌肉上，用3-0医用缝合线逐层缝合切口，暴露于切口外的导管埋置于皮毛中，通过导管分别于手术中及术后1、2 d给予200 ?滋l rrtnf或假手术组仅给予200 ?滋l rrtnf的溶剂—— 1 g/l牛血清白蛋白(bovine serum albumin， bsa)盐水，给药结束后用烧热的镊子封闭管口。
1.3 免疫组织化学
1.3.1 动物灌注和标本处理
大鼠在按实验设计饲养规定的时间后，用乌拉坦(氨基甲酸乙酯，1.5 g/kg)腹腔注射麻醉，先后用生理盐水和40 g/l多聚甲醛溶液(ph 7.2 ～ 7.4， 4 ℃)对动物进行主动脉灌流固定30 min。解剖动物取出同侧l4和l5 drg，多聚甲醛溶液后固定3 h，再于300 g/l蔗糖溶液中脱水3 d。标本经冰冻切片后收集于24孔板内，并置于4 ℃冰箱短暂保存。具体实验方法参见我们的近期报道[7]。
1.3.2 免疫荧光组织化学染色及定量分析
将drg冰冻切片用0.01 mol/l pbs洗3次，每次5 min，加入封闭液1 h，吸去封闭液并加入抗-nav1.3抗体(1：100;sigma， st. louis， usa)。4 ℃过两夜后，吸去一抗，加入标记cy3的igg(1：300;jackson immunoresearch， pa)，避光作用1 h后贴于载玻片上，于荧光显微镜下观察并拍照。免疫染色结果的定量分析是通过计数每张切片上的nav1.3 免疫活性(nav1.3 immunoreactivity， nav1.3-ir)阳性细胞的百分比获得的。具体实验方法和定量分析参见我们的近期报道[7]。
1.4 成年大鼠drg神经元的分离培养
正常雄性sd大鼠，麻醉、低温下，迅速取出腰骶部脊柱，尽量剪净脊柱两侧的肌肉组织。把脊柱从正中剪开，分成左右两半，放入解剖液中(dmem液)。从解剖液中取出脊柱，用镊子取出脊髓，轻轻取出双侧椎间孔中的l4、l5、l6 drg放入含解剖液的培养皿中。用巩膜剪剪除drg上的神经根，吸干培养皿中的解剖液，尽量剪碎drg。然后将剪碎的drg放入消化液(1.25 g/l胰酶 + 1.25 g/l胶原酶) 37 °c振荡消化15 ～ 20 min，加入血清终止消化。静止5 min，取上清液于另一离心管中，800 × g离心5 min。弃上清，加入培养基(dmem-f12 + 100 g/l胎牛血清)重悬沉淀，并滴于24孔板或盖玻片中，置co2培养箱(体积分数为95%空气 + 5%co2)孵育培养3 ～ 5 d。
1.5 免疫细胞化学染色及定量分析
将培养于盖玻片上的细胞置于40 g/l多聚甲醛溶液中(ph 7.2)， 4 ℃固定过夜。用不含ca2+和mg2+ 的磷酸缓冲液(ca2+ and mg2+ free phosphate buffer saline，cmf-pbs)洗3次，每次5 min。3 g/l triton x-100 室温处理5 min后，用30 g/l驴血清室温封闭1 h。滴加兔抗-nav1.3抗体(1：100;sigma， st. louis， usa)，4 ℃ 过夜后，吸去一抗，用0.01 mol/l pbs洗3次，每次5 min，加入标记cy3的igg(1：300; jackson immunoresearch， pa)，室温下避光作用30 min，立即于共聚焦显微镜(olympus fv500)下观察并拍照。
对于共聚焦检测的drg神经元的定量分析是通过测量其胞膜和胞质的荧光灰度水平进行的。随机选取10个视野，每个视野随机选取5个细胞，分别在每个细胞的胞膜和胞质内随机选取3个点，测量并比较两者的灰度值(细胞数n = 50)。
1.6 药物使用
重组性大鼠tnf-α(recombinant rat tnf-α，rrtnf， r&d systems， inc) 以10 ?滋g/ml 做为母液储存于-70 ℃，给药前用含有1 g/l的牛血清白蛋白(bovine serum albumin，bsa)盐水稀释成100 pg/ml，经pe-10导管于坐骨神经周围每次给予200 ?滋l(术中和术后共3次)，或者直接作用于培养的drg神经元表面。
1.7 统计学分析
所有统计学分析均通过spss 10.0软件(spss inc，usa)进行，实验结果以均数 ± 标准误(mean ± se)表示。实验数据的处理使用t检验(student?蒺s t-test)进行两组间差异比较。p < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 坐骨神经周围给予rrtnf对drg神经元nav1.3表达的影响
结果如图2所示，假手术组大鼠(sham组， n = 6)的l5 drg内几乎检测不到nav1.3的表达(1.25 ± 0.34)%;与假手术组相比，pst大鼠在术后7 d的损伤侧l5 drg内，nav1.3表达显著增强，其阳性细胞百分比显著升高[(18.75 ± 0.97)%， p < 0.001， n = 6]。l4 drg的检测结果与上述结果相似，pst 7 d大鼠nav1.3-ir阳性细胞百分比为(15.24 ± 1.41)% 显著高于假手术组大鼠(1.30 ± 0.42)% (p < 0.001， n = 6)。
2.2 离体培养的drg神经元表面给予rrtnf对nav1.3表达的影响
共聚焦检测结果如图3所示，在培养的正常成年大鼠drg神经元内几乎没有nav1.3的表达(a，vehicle组)， rrtnf可显著诱导nav1.3上调，nav1.3阳性信号在drg神经元胞膜和胞浆中均有高表达(b)。定量分析结果(c)表明，与溶剂对照组(胞浆6.73 ± 0.46，胞膜6.58 ± 0.33)相比，给予rrtnf后nav1.3的荧光灰度水平在drg神经元胞浆(14.49 ± 0.63， p < 0.001)和胞膜(19.11 ± 0.55， p < 0.001)中都有升高，并且以胞膜上调更为显著(p < 0.001)。
3 讨 论
我们近期研究已表明在大鼠一侧坐骨神经周围给予100 pg/ml的rrtnf(pst)可引起双侧后肢机械性痛超敏和drg神经元内tnf-α的持续上调[5]。本实验进一步观察了pst大鼠drg内nav1.3的表达变化，以求解释drg内tnf-α上调的致痛敏机制。
nav1.3是一种在正常大鼠胚胎神经系统中表达水平较高的钠通道，出生后其表达水平逐渐下降，至成年时nav1.3在脊髓和drg细胞内几乎无表达[8]。而当外周神经受损后，成年大鼠drg神经元可出现nav1.3的再表达[8-9]。为避免神经损伤和鼠龄因素对drg内nav1.3的基础表达造成影响，本研究选用正常成年大鼠的drg进行低温下取材分离培养，观察在培养的drg神经元表面给予rrtnf(100 pg/ml) 5 h对nav1.3基础表达的直接影响。
本研究发现：大鼠坐骨神经表面慢性给予rrtnf(pst)在引起病理性疼痛[5]的同时，也引起l5/l4 drg神经元内nav1.3显著上调;在分离培养的正常成年大鼠drg神经元表面直接给予rrtnf显著诱导nav1.3表达上调，其上调在drg神经元胞膜和胞浆中均有，以胞膜上调更为显著。以上结果表明rrtnf不仅引起drg神经元内nav1.3总蛋白表达增加，也引起nav1.3功能性蛋白(膜蛋白)表达增加。
在此，本文对rrtnf引起drg内nav1.3上调的意义进行以下探讨。1974年wall和gutnick首次报道[10]，切断大鼠坐骨神经形成神经瘤后，在下腰部背根(感觉神经)可记录到大量的异位冲动。进一步研究表明，神经损伤不仅可使被损伤的感觉神经产生异位冲动，还会使临近未被损伤的神经元产生异位冲动[11]。因此，传入神经产生的异位冲动可能在病理性疼痛形成中起关键作用。研究表明，异位冲动的产生可能与感觉神经元上nav1.3的表达改变有关[12]。nav1.3是一种来源于鼠脑克隆的ttx敏感型钠通道，又可称为脑ⅲ型钠通道，其在正常大鼠胚胎期具有较高水平的表达，至成年时，其在脊髓和drg细胞内几乎无表达[8]。然而，当用不同方式损伤外周神经后，成年大鼠drg神经元可出现nav1.3的再表达[8-9]。相反，其它的ttx敏感型钠通道(nav1.1、nav1.2、nav1.6、nav1.7)和ttx抵抗型钠通道(nav1.8、nav1.9)在脊神经或坐骨神经损伤后出现显著下调[13-14]。hains等[15]发现脊髓顿挫伤后会导致脊髓背角(dorsal hom， dh)神经元过度兴奋以及中枢性神经痛，在脊髓损伤4周后发现dh的navl.3表达上调，而鞘内注射针对navl.3的反义寡核昔酸可导致nav1.3的表达下调，减少dh神经元的过度兴奋，并减轻脊髓损伤后机械性痛觉过敏和热觉超敏，停止使用反义寡核昔酸后，nav1.3蛋白表达和dh神经元的过度兴奋以及疼痛相关的行为学均恢复。这些提示nav1.3与中枢性神经痛相关的神经过度兴奋具有某种功能联系。我们近期研究已发现，腰5脊神经前根切断(l5-vrt)[4]或pst痛模型大鼠[5]的drg神经元上都有tnf-α的持续上调。而本研究结果表明外源性tnf(rrtnf)可引起在体和体外培养的大鼠drg神经元nav1.3表达增加。因此推测，外周神经损伤通过引起drg内tnf-α上调，并进一步促发nav1.3异常表达，引起初级感觉传入异常兴奋，参与病理性疼痛的产生。
【参考文献】
watkins lr， maier sf. beyond neurons： evidence that immune and glial cells contribute to pathological pain states[j]. physiol rev， 2002， 82(4)： 981-1011.
wieseler-frank j， maier sf， watkins lr. immune-to-brain communication dynamically modulates pain： physiological and pathological consequences [j]. brain behav immun， 2005， 19(2)： 104-111.
liefner m， siebert h， sachse t， et al. the role of tnf-alpha during wallerian degeneration[j]. j neuroimmunol， 2000， 108(1-2)： 147-152.
xu jt， xin wj， zang y， et al. the role of tumor necrosis factor-alpha in the neuropathic pain induced by lumbar 5 ventral root transection in rat[j]. pain， 2006， 123(3)： 306-321.
wei xh， zang y， wu cy， et al. peri-sciatic administration of recombinant rat tnf-alpha induces mechanical allodynia via upregulation of tnf-alpha in dorsal root ganglia and in spinal dorsal horn： the role of nf-kappa b pathway [j]. exp neurol， 2007， 205(2)： 471-484.
lindia ja， kohler mg， martin wj， et al. relationship between sodium channel nav1.3 expression and neuropathic pain behavior in rats[j]. pain， 2005， 117(1-2)： 145-153.
臧 颖，陈秋英，李玉莹，等. nf-kappab、p38 mapk和jnk通路在运动神经损伤引起的大鼠病理性疼痛中的作用及机制 [j]. 中山大学学报：医学科学版， 2009，30(6)：645-651.
waxman sg， kocsis jd， black ja. type iii sodium channel mrna is expressed in embryonic but not adult spinal sensory neurons， and is reexpressed following axotomy [j]. j neurophysiol， 1994， 72(1)： 466-470.
lindia ja， kohler mg， martin wj， et al. relationship between sodium channel nav1.3 expression and neuropathic pain behavior in rats[j]. pain， 2005， 117(1-2)： 145-153.
wall pd， gutnick m. properties of afferent nerve impulses originating from a neuroma[j]. nature， 1974， 248(5451)： 740-743.
michaelis m， liu x， janig w. axotomized and intact muscle afferents but no skin afferents develop ongoing discharges of dorsal root ganglion origin after peripheral nerve lesion [j]. j neurosci， 2000， 20(7)： 2742-2748.
wood jn， boorman jp， okuse k， et al. voltage-gated sodium channels and pain pathways [j]. j neurobiol， 2004， 61(1)： 55-71.
dib-hajj s， black ja， cummins tr， et al. nan/nav1.9： a sodium channel with unique properties [j]. trends neurosci， 2002， 25(5)： 253-259.
kim ch， oh y， chung jm， et al. changes in three subtypes of tetrodotoxin sensitive sodium channel expression in the axotomized dorsal root ganglion in the rat [j]. neurosci lett， 2002， 323(2)： 125-128.
hains bc， klein jp， saab cy， et al. upregulation of sodium channel nav1.3 and functional involvement in neuronal hyperexcitability associated with central neuropathic pain after spinal cord injury [j]. j neurosci， 2003， 23(26)： 8881-8892.
