【摘要】 目的 检测ezrin基因在几种癌细胞中的表达及其5′侧翼区序列的转录活力，探讨ezrin基因在癌细胞的表达调控机制。方法 采用逆转录聚合酶链反应（rt pcr）及western blot法检测ezrin基因在食管癌细胞ec109、ec171、ec8712、sheec，胃癌细胞n87、bgc823，肺癌细胞a549、95d，肝癌细胞hepg2，白血病细胞k562和宫颈癌细胞hela中的mrna和蛋白表达水平；采用pcr法构建以ezrin基因翻译起始位点上游-1444/+134序列为启动子的真核细胞表达质粒pglbhe(-1444/+134)；采用双荧光素酶报告基因分析系统检测-1444/+134序列在ec109、hela、a549和bgc823细胞中的转录活力。结果 ezrin基因在食管癌等几种癌细胞中均有高表达，其5′侧翼区-1444/+134序列具有较强的转录活力。结论 ezrin基因5′侧翼区序列的转录活性可能对ezrin基因的几种癌细胞中的高表达起重要作用。
【关键词】 逆转录聚合酶链反应 western blot检测 双荧光素酶报告基因分析
ezrin蛋白是erm (ezrinradixinmoesin)家族成员之一, 主要参与细胞骨架与胞膜之间的连接 [1]。研究证明，ezrin基因在食管癌、胰腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌以及其他多种肿瘤细胞中过表达[26]。wWw.11665.COM分析ezrin基因的外显子、内含子以及转录起始位点上游3 000 bp以内的dna序列，结果发现，ezrin基因转录起始位点上游约1 600 bp的范围为高gc含量区，存在cpg岛，且含有转录因子sp1的众多潜在结合位点。然而，ezrin基因在肿瘤细胞中的表达是否受到cpg岛甲基化或转录因子sp1的调控，调控位点又在哪里？这些问题迄今仍不明确。本研究对我们实验室现有的几种癌细胞进行ezrin基因表达检测，同时克隆ezrin基因5′侧翼高gc含量区序列，检测此序列在癌细胞中的转录活力，为进一步揭示ezrin基因在癌细胞中的表达调控机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 质粒、细胞系及主要试剂
质粒pgl3basic (pglb)、pgl3promoter (pglp)和prltk购自promega公司。
食管癌sheec细胞株为本实验室建立[7]，其余细胞株购自中国科学院细胞库。
trizol试剂、199培养基、dmem培养基购自invitrogen公司；限制性内切酶、逆转录系统试剂盒、pcr mix、双荧光素酶报告基因分析系统购自promega公司；pvdf膜购自millipore公司；ezrin ab1（3c12）购自neo markers公司；βactin抗体（ac15）购自sigma公司；标准蛋白分子量（sc2035）、羊抗鼠igghrp（sc2031）、化学发光试剂购自santa cruz公司。superfect转染试剂、质粒提取试剂盒购自qiagen公司。其他常用试剂为国产分析纯试剂。
1.2 细胞培养
所有细胞均置于37℃、5％co2、饱和湿度的培养箱中培养。ec109（食管癌）、ec171（食管癌）、ec8712（食管癌）、sheec（食管癌）、bgc823（胃癌）、hela（宫颈癌）等细胞贴壁生长于含10%灭活小牛血清的199培养液中；n87（胃癌）、a549（肺癌）、95d（肺癌）、hepg2（肝癌）等细胞贴壁生长于含10%灭活小牛血清的dmem培养液中。贴壁细胞培养成单层后，用0.25%胰蛋白酶（含0.02% edta）消化，传代培养，待达到一定数目[（1～2)×107]后收获细胞。k562（髓性白血病细胞株）细胞悬浮生长于含10%灭活小牛血清的rpmi199培养液中，细胞密度保持在(0.1～0.5)×106 cells/ml，每3天传代一次，当密度达到(1.0～1.5)×106 cells/ml时收获细胞。
需要进行瞬时转染实验的细胞接种于96孔培养板中，每孔100μl，细胞接种密度为2×105 cells/ml。细胞置37℃培养，细胞满度约为50%～60％时，转染质粒。
1.3 逆转录聚合酶链反应（rt pcr）
trizol试剂提取细胞总rna，经逆转录获得cdna。扩增ezrin基因部分序列的上、下游引物分别为5′cgggcgctctaagggttct3′和5′tttcggtttctggtgagtatcctcgatccc3′，扩增片段位于ezrin基因的+30/+134（转录起始位点定义为+1）。扩增gapdh基因的上下游引物分别为5′gaaggtgaaggtcggagtc3′和5′gaagatggtgatgggatttc3′，扩增片断位于gapdh基因的+108/+333（转录起始位点定义为+1）。将两对引物放入同一pcr反应体系，反应条件如下：94℃ 5min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，循环30次；72℃ 5min。扩增产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳，于fluorchem tmis8900成像系统（alpha innotech, usa）分析成像，计算目的基因产物（ezrin）和内对照基因产物(gapdh)的灰度比值。
1.4 细胞总蛋白质的提取
收集细胞团块，用4℃预冷的pbs（0.01 m, ph 7.2～7.4）重悬细胞，每瓶细胞（30cm2的培养瓶）加400μl裂解液（50mm tris.hcl ph 8.0, 150mm nacl, 1% triton x100, 100μg/ml pmsf），于冰上裂解30min，4℃下12 000r/min离心5min。离心后的上清即为细胞总蛋白。
蛋白含量的测定采用bradford法。
1.5 western blot分析
50μg细胞总蛋白提取物进行12％ sds聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白电转至pvdf膜上，5％脱脂奶粉封闭1h；加入鼠抗ezrin抗血清和鼠抗βactin抗血清，室温孵育1h，pbst（0.01 m, ph 7.2～7.4，0.05％ tween 20）洗2次，pbs洗1次；再加入羊抗鼠igghrp，室温孵育1h，pbst洗2次，pbs洗1次；最后加入western blot化学发光试剂，于fluorchem tmis8900成像系统（alpha innotech, usa）进行成像分析，计算ezrin和对照βactin的灰度比值。
1.6 ezrin基因5′侧翼区序列的克隆
扩增ezrin基因5′侧翼区序列的下游引物为5′cccaagct+134ttcggtttctggtgagtatcctcgatccc3′(下划线为hindⅲ酶切位点；ezrin基因转录起始位点定义为+1，翻译起始位点在+135，碱基所在位置标注在右上角)；利用软件primer premier 5.0设计上游引物5′t-1529taaccagagcttcggaaaggcgg3′。扩增片段包含了ezrin基因翻译起始位点上游的高gc含量区。以食管癌细胞基因组dna为模板进行pcr扩增，反应条件为：94℃ 5min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 2min，循环30次；72℃ 5min。扩增片段中含有stuⅰ酶切位点aggcct，位于在ezrin基因的-1447/-1442处，将扩增产物经stu ⅰ/hindⅲ双酶切，定向连接至经smaⅰ/hindⅲ双酶切不含启动子的萤火虫荧光素酶报告基因表达载体pglb上，构建重组质粒pglbhe(-1444/+134)。采用kpnⅰ/hindⅲ双酶切鉴定重组质粒，同时进行dna测序分析。
1.7 瞬时转染
提取质粒并测定其含量。用buffer eb（qiagen公司质粒提取试剂盒中提供）将实验质粒pglb、pglp、pglbhe(-1444/+134)稀释至100ng/μl，内参照质粒prltk稀释至20ng/μl，然后将实验质粒分别与prltk按50∶1混合，即1μg∶0.02μg。具体转染步骤参照superfect转染试剂操作手册进行。转染后48h后，收获细胞。每组实验样品3个平行实验孔，并至少进行3 次重复实验。
1.8 双荧光素酶活性检测及统计学分析
参照双荧光素酶报告基因分析系统操作手册，在td20/20照度计（turner designs公司）上进行双荧光素酶活性检测。根据td20/20型照度计配置的软件包计算出各组转染细胞的相对荧光素酶活性（萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶），以此代表实验质粒启动子的转录活力。各组实验数据均计算平均值及标准差。应用ssps13.0软件对各组实验数据之间差异是否有统计学意义进行t检验。
2 结果
2.1 ezrin基因在几种癌细胞中的mrna表达
rtpcr扩增ezrin基因片段的长度为105bp，扩增gapdh片段的长度为226bp。电泳结果显示，在所检测的食管癌等11种癌细胞中均有两条特异性扩增条带，且条带位置与预期相符，阳性率为100%。利用fluorchem tmis8900成像系统分析扩增条带的灰度值。gapdh为看家基因，在各种组织和细胞中的表达相对稳定，以gapdh的扩增产物作为对照，计算各细胞ezrin基因与gapdh基因扩增产物的比值，将食管癌细胞ec109的ezrin/gapdh灰度比值定义为1，其他癌细胞与ec109比较。可以看出，与已经被证实高表达ezrin基因的ec109相比，所检测的其他几种癌细胞ezrin基因mrna的表达水平在0.77～1.07之间，见图1。
2.2 ezrin蛋白在几种癌细胞中的表达
ezrin蛋白分子量为82 kda。βactin是肌动蛋白的一种，分子量为42kda，在各种组织和细胞中的表达相对稳定，在此作为内对照。细胞总蛋白western blotting检测结果显示，在所检测的几种癌细胞中均有ezrin蛋白表达。利用fluorchem tmis8900成像系统分析蛋白条带，计算各癌细胞ezrin和βactin的灰度比值，将食管癌细胞ec109的ezrin/βactin比值定义为1，其他癌细胞与ec109比较。可以看出，与ec109相比，所检测的其他几种癌细胞ezrin蛋白的表达水平在0.79～1.32之间，见图2。
m: dna marker; 1: ec109; 2: ec171; 3: ec8712; 4: sheec; 5: n87; 6: bgc823; 7: hela; 8: a549; 9: 95d; 10: hepg2; 11: k562
图1 ezrin基因mrna在几种癌细胞中
表达的rtpcr检测
m: protein marker; 1: ec109; 2: ec171; 3: ec8712; 4: sheec; 5: n87; 6: bgc823; 7: hela; 8: a549; 9: 95d; 10: hepg2; 11: k562
图2 ezrin蛋白在几种癌细胞中
表达的western blotting检测
2.3 ezrin基因5′侧翼区序列的克隆鉴定
含有ezrin基因-1444/+134序列的重组质粒pglbhe(-1444/+134)的kpnⅰ/hindⅲ双酶切鉴定结果显示，重组质粒所连接的外源片段长度与预计值一致。质粒测序结果也证实所克隆序列为ezrin基因5′侧翼区序列（genbank登录号：ef184645），见图3。
2.4 ezrin基因-1444/+134序列在几种癌细胞中的转录活力
质粒pglb、pglp和pglbhe(-1444/+134)分别与内参照prltk共转染ec109、hela、a549和bgc823细胞。以含sv40启动子的质粒，pg4的相对荧光光素酶活性为1来计算同一细胞系中pglb和pglbhe(-1444/+134)的相对酶活性。结果显示，在所检测的几种癌细胞中，不含启动子序列的pglb基本不表现荧光素酶活性（相对值为0.01～0.03）；以ezrin基因-1444/+134序列作为启动子的pglbhe(-1444/+134)表现出较强的荧光素酶活性，是pglp的4～10倍，见图4。这说明，ezrin基因的-1444/+134序列在癌细胞中具有很强的转录活力，有可能是调控ezrin基因转录的重要区域。
3 讨论
ezrin蛋白是一种磷酸化蛋白质，主要表达于各种类型的上皮细胞及某些非上皮细胞，具有广泛的生理功能。我们曾研究发现[2,8]，ezrin基因在永生化食管上皮细胞恶性转化为食管癌细胞过程中显著异常过表达，通过rnai手段下调ezrin基因的表达可以有效阻止食管癌细胞的移动、侵袭等肿瘤细胞生物学行为，在临床食管癌组织中发生明显的ezrin蛋白移位表达现象，提示ezrin是食管癌转移侵袭相关基因。
ezrin基因5′侧翼区存在cpg岛和转录因子sp1的众多潜在结合位点，为了明确ezrin基因的表达是否受其5′侧翼区序列调控，我们首先检测了实验室现有几种细胞株的ezrin基因表达情况，结果发现，ezrin基因在所检测的几种癌细胞中均有高水平表达。由于没有明显低表达ezrin基因的细胞株，甲基化实验暂时无法进行，不能确定是否存在5′侧翼区cpg岛甲基化调控ezrin基因的表达。然而，-1444/+134序列的报告基因检测结果显示，ezrin基因5′侧翼区序列具有很强的转录活力，很可能对ezrin基因在癌细胞中的高表达起重要作用。近期，我们针对ezrin基因在食管癌细胞中的转录调控进行了深入研究，结果发现，在ezrin基因-1444/+134序列中含有增强子区和基本启动子活性区，对基本启动子活性起重要调控作用的元件包括一个经典的sp1结合位点（-75/-69）和一个经典的ap1结合位点（-64/-58）。过表达cfos能够提高ezrin基因基本启动子活性；sp1特异性化学抑制剂mithramycin a能够阻断核蛋白因子与含有sp1位点的dna序列的结合，同时降低ezrin基因基本启动子活性。我们认为在食管癌细胞中，转录因子sp1和ap1共同调控ezrin基因的基本转录活性（另文发表）。ezrin基因在其他癌细胞中是否具有相同的转录调控机制，还需进一步研究。
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