【摘要】 目的 克隆人tfpi2基因全长cdna，构建其真核表达载体，并将其转染到人胰腺癌细胞panc1中，检测其表达。方法 用rtpcr法从人胎盘组织中扩增人tfpi2基因，并将其与真核表达载体pegfpc1连接，构建真核表达载体pegfpc1tfpi2。将构建的重组载体转染到人胰腺癌细胞系panc1细胞，western blot检测tfpi2在panc1细胞中的表达。结果 rtpcr成功的扩增出一条约708bp的片断，扩增片断与载体连接后，经限制性内切酶酶切电泳分析和dna序列测定证实该基因已经成功构建到载体上，转染panc1细胞后，荧光显微镜观察到稳定转染细胞发出较强绿色荧光，western blot技术证明tfpi2基因能在panc1细胞中稳定表达。结论 成功构建了人tfpi2基因的真核表达载体pegfpc1tfpi2，获得了稳定表达tfpi2的panc1细胞，证实tfpi2基因能够在人胰腺癌细胞系panc1中高效、稳定的表达，为进一步研究其胰腺癌迁移、浸润及转移中的作用打下基础。
【关键词】 胰腺肿瘤 真核表达载体 组织因子途径抑制物
组织因子途径抑制物2( tissue factor pathway inhibitor2,tfpi2)是一种新近发现的丝氨酸蛋白酶抑制物，可能在维持细胞外基质（extracellu larmatrix,ecm)结构完整以及调控肿瘤细胞浸润转移方面起着重要作用。wWW.11665.cOm我们通过克隆人tfpi2基因、构建其真核表达载体，并将其转染胰腺癌细胞系，以便进一步探讨其对胰腺癌细胞生长、浸润及转移的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
人胰腺癌细胞系panc1购自中科院细胞库；dmem培养基购自hyclone公司；rna 抽提试剂 trizol regent 购自 gibco brl 公司；rtpcr 试剂盒购自promega 公司；dna 聚合酶 pfu、dntp 购自申能博彩公司；限制性内切酶ecorⅰ和salⅰ、t4dna连接酶购自 neb 公司；质粒抽提试剂盒、dna 凝胶回收试剂盒购自华舜公司；大肠杆菌dh5α、质粒pegfpc1由本实验室保存；pcr system 2400 pcr 扩增仪购自 pe 公司；smartspec 3000 分光光度计购自 biorad 公司；lipofectamine2000转染试剂盒购自invitrogen，多克隆抗兔tfpi2抗体，辣根过氧化物酶（hrp）标记兔抗鼠igg，单克隆鼠抗gapdh，dba显色试剂盒购自santa cruz公司。
1.2 方法
1.2.1 引物设计合成 人tfpi2基因的特异性引物由宝生物工程（大连）合成，在上游引物和下游引物的5′端分别引入ecorⅰ和salⅰ的酶切位点（下划线序列）。上、下游引物序列分别为：5′cagaattctatggaccccgctcgcccc3′和5′cagtcgacttaaaattgcttcttccg3′，扩增产物大小为708bp。βactin作为内参照，上、下游引物分别为5′gctcgtcgtcgacaacggct3′和5′ caaacatgatctgggtcatcttctc3′,扩增产物为353bp。
1.2.2 rtpcr扩增目的基因tfpi2 取新鲜胎盘组织，切成小块立即放入液氮冻存。在液氮中将组织研碎，取约100mg按照trizol试剂说明提取总rna，经凝胶电泳和紫外分光光度计分析后，按promega公司 rna pcr kit 说明书操作，两步法rtpcr，先逆转录制备单链cdna，再以逆转录产物为模板，用上、下游引物进行 pcr反应扩增目的基因，反应条件：95℃预变性5min，然后 94℃变性30s，56℃退火 30s，72℃延伸30s，进行30个循环，最后72℃延伸5min，4℃保温。扩增片段用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.2.3 真核表达载体pegfpc1tfpi2的构建及鉴定 pcr产物经酚/氯仿抽提、乙醇沉淀纯化后，进行ecorⅰ和salⅰ双酶切反应，用1%琼脂糖凝胶电泳回收，再与经同样处理的质粒pegfpc1进行连接反应。取感受态大肠杆菌200μl，加10μl连接产物，冰浴10～30min。热激37℃×5min或 42℃×90s，加1ml lb培养液，振荡培养37℃×200r/min×60min,吸取 200μl 菌液涂布含筛选用抗生素的lb平板。37℃静置培养 12～16h，待其长出单克隆菌落。挑取阳性克隆扩大培养，质粒提取试剂盒提取少量提取质粒进行限制性酶酶切鉴定，并测定dna序列。测序正确后命名为pegfpc1tfpi2。
1.2.4 细胞培养及转染 panc1细胞用含10％胎牛血清的dmem培养基于37℃，5％co2的培养箱传代培养。将传代后培养3天的panc1细胞接种于12孔培养板，按照lipofectamine2000说明书分别将重组质粒pegfpc1tfpi2和空载体pegfpc1转染到panc1细胞，同时以未转染细胞做对照。转染48h后用含有g418的dmem培养基选择培养，待抗性细胞克隆形成后，扩大培养，继续用g418筛选得到稳定传代的转染细胞系。
1.2.5 荧光显微镜检测荧光蛋白表达 将稳定转染的panc1细胞置于倒置荧光显微镜，观察绿色荧光的表达。
1.2.6 western blot检测转染后panc1中tfpi2蛋白的表达 提取细胞外基质（ecm）蛋白[1]，测定蛋白浓度，制备12％的sdspage凝胶，并进行蛋白质电泳，电泳分离后，恒压转移到pvdf膜上，用含5％脱脂牛奶的tbst缓冲液封闭，4℃过夜。tbst 1∶2 000稀释抗tfpi2多抗，室温培育1.5h，tbst洗5次，再用hrp标记的抗鼠二抗培育1h，显色，显影。同时以gapdh作为内参。
2 结果
2.1 rtpcr扩增产物
提取的人胎盘组织总rna，经rtpcr扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳，在dna相对分子质量700bp附近有一条亮带，与预期目的基因大小（708bp）基本一致，见图1。
1:dna marker,100bp dna ladder；
2:rtpcr产物；3:βactin
图1 rtpcr扩增产物凝胶电泳
2.2 真核表达载体pegfpc1tfpi2 的构建及鉴定
pcr产物经 ecorⅰ和salⅰ双酶切后与经同样酶切的质粒 pegfpc1连接重组，转化感受态大肠杆菌 dh5α。重组质粒经ecorⅰ和salⅰ双酶切鉴定片段长度与理论预测一致。此重组质粒命名为pegfpc1tfpi2。核苷酸序列分析结果证实，pcr 扩增的 tfpi2 基因（含信号肽编码区）完全正确，引入的酶切位点与设计完全相符，见图2。
1：dna marker，λ（dna/hindⅲ+ecorⅰ）；2：pegfpc1的ecorⅰ和salⅰ双酶切；3：pegfpc1tfpi2的ecorⅰ和salⅰ双酶切；4：dna marker: dl2000
图2 重组pegfpc1tfpi2双酶切电泳
2.3 绿色荧光蛋白的表达
在荧光显微镜下观察稳定转染的panc1细胞中绿色荧光蛋白的表达情况，转染重组质粒pegfpc1tfpi2的 panc1细胞可见绿色荧光，未转染的panc1细胞未见到绿色荧光，见图3。
a：未转染；b：转染
图3 未转染及转染pegfpc1tfpi2的
panc1细胞在倒置荧光显微镜下表现
2.4 tfpi2蛋白的检测
转染pegfpc1tfpi2的panc1细胞经western blot证实有32 000、31 000和27 0003种分子量的tfpi2蛋白的表达，转染空载体pegfpc1和未转染的panc1细胞无任何一种蛋白的表达，见图4。
上图:tfpi2蛋白；下图：内参gapdh 1：未转染细胞；2：转染pegfpc1tfpi2细胞；3：转染pegfpc1细胞
图4 转染及未转染pegfpc1tfpi2细胞
中tfpi2蛋白表达检测
3 讨论
tfpi 2基因位于人类染色体7q22，全长约7.0kb，广泛分布于人类肝、胰腺、肾、心、骨骼肌和前列腺等正常组织[2]，其编码产物组织因子途径抑制物2是广谱丝氨酸蛋白酶抑制物，在体外可强烈抑制纤溶酶、胰蛋白酶，基质金属蛋白酶1（mmp1）和3(mmp3)的活化。而纤溶酶、组织蛋白酶以及金属蛋白酶1（mmp1）和3(mmp3)参与ecm的重塑过程，在肿瘤细胞侵袭转移等一系列生理和病理过程中扮演重要角色[3]。因此，tfpi2可能通过对这些酶的抑制来维持ecm的结构完整，调控肿瘤细胞的侵袭转移。现已发现多种肿瘤如神经胶质瘤、绒毛膜癌、黑色素瘤以及肺癌等的发生、发展都与tfpi2基因的表达减少有关，而且肿瘤的恶性程度越高，该基因的表达就越少[47]。
与其他肿瘤相比，胰腺癌发生转移早且较严重，有90％侵犯神经束膜、70％～80％累计淋巴结、50％累计静脉，是导致患者丧失手术机会、5年生存率低的关键原因所在。tfpi2基因对许多恶性肿瘤的生长以及浸润、转移有广泛抑制作用的特点已引起人们的关注，我们从人胎盘组织成功克隆了tfpi2基因，并构建了其真核表达载体pegfpc1tfpi2，而且将其稳定转染到人胰腺癌细胞系panc1细胞，获得了稳定表达tfpi2基因的细胞克隆，为进一步探讨tfpi2在胰腺癌细胞侵袭转移中的作用、胰腺癌的临床预后及其基因治疗提供了实验依据。
【参考文献】
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