【摘要】 目的：观察葛根素预处理在体大鼠心肌缺血再灌注损伤(i/r)时是否抑制核因子（nf）-κbp65蛋白表达并减少循环和心脏局部肾素-血管紧张素系统（ras）水平。方法：建立在体大鼠心肌i/r模型,设立假手术组、i/r组和葛根素预处理组。以氯化四唑染色法测定各组心肌梗死面积；测定心肌酶学水平和光镜改变；应用免疫组织化学法定性检测心肌组织nf-κbp65蛋白活化的细胞定位；以酶联免疫吸附法（elisa）检测nf-κbp65蛋白及其dna结合活性；以放射免疫分析法测定血浆和心肌组织血管紧张素ⅱ（angⅱ）含量。结果：与i/r组比较, 葛根素预处理组心肌梗死面积明显缩小，心肌酶学水平浓度明显降低( p均<0.05 )；血浆和心肌组织angⅱ含量显著降低及nf-κbp65的蛋白活性明显受抑(p均<0.05 )。结论：葛根素预处理可经抑制nf-κbp65蛋白表达并减少循环和心脏局部ras水平，从而减轻心肌缺血再灌注损伤。
【关键词】 心肌再灌注损伤；nf-κb；血管紧张素ⅱ；葛根素
preconditioning of puerarin reduce the myocardial ischemia/reperfusion injury by inhibiting the transcription of nf-κb/wu liming，jiang ting，yei rong,jin ting,yang rui,wang fenzhen//chinese journal of cardiovascular rehabilitation medicine,2009,18(2):185
abstract：objective:to investigate whether preconditioning of puerarin could inhibit both nf-κb 65protein activation and circulatory or cardiac local ras in rat with myocardial ischemia/reperfusion injury(i/r).methods:thirtysix healthy male sd rats were randomly divided into shamoperated group (sham group)， i/r model group and puerarin preconditioning group (n=12).myocardial infarct size was measured by ttc.serum myocardial enzymes were measured and light microscopic study was performed; the localization of nf-κb was detected by immunohistochemistry and the quantitation of activated nf-κb was detected by enzymelinked immunosorbent assay(elisa); the plasma and myocardium angⅱ content was measured by radioimmunoassay method. results:compared with i/r group, infarction area was significant smaller in the puerarin pretreatment group (p<0.05) and myocardial enzyme levels were significantly lower (p<0.05 all).the angⅱ content in circulation and cardiac myocyte significantly decreased(p<0.05 all).conclusion:preconditioning of puerarin could reduce i/r by inhibiting nf-κbp65 protein activity and reducing the levels of angⅱ both circulation and local heart.
author′s address：department of cardiology,union hospital,fujian medical university,fuzhou,fujian,350001,china
key words：myocardial reperfusion injury；nf-kappa b ；angiotensinⅱ ；puerarin
核因子－κb （nf-κb）是一组多向性核转录调节因子，参与炎症、免疫反应、细胞凋亡和肿瘤发生等多种生物进程。Www.11665.coM心肌缺血再灌注损伤（miri，i/r）时可激活对氧化还原敏感的nf-κb，并同时迅速激活肾素- 血管紧张素系统(ras)。葛根素(puerarin)具多种药理作用，已报道其抑制nf-κb的活性并延缓抑制型κb（iκb）的降解而降低循环和组织血管紧张素angⅱ(angⅱ)含量。有报道葛根素预处理可明显减轻大鼠miri，类似于缺血预处理[1]。本研究旨在初步验证葛根素预处理对miri的保护作用是否与抑制nf-κbp65蛋白的活性，而减轻ras激活相关。
1 资料与方法
1.1 实验动物分组
健康雄性清洁级sd大鼠共36只，均分为3组（每组12只）：（1）假手术组；（2）缺血(30min)再灌注(60min )（ir）组；（3）葛根素预处理组：葛根素 100mg/kg，于miri前15 min颈外静脉缓慢推注。
1.2 实验材料
（1）tkr-200c小动物呼吸机：江西特力麻醉呼吸设备公司;（2） 组织脱水机: 德国tp 1020；（3） 组织包埋机: 湖北孝感亚光电子技术研究所；（4）组织切片机:德国leica-rm 20259；（5） 数码相机: 日本尼康coolpix 2500；（6）心电图机：rm-6200c型生理记录仪；（7） 全自动生化分析仪：日本东芝120fr13；（8） 解剖显微镜：日本olypus；（9）电子天平：美国al104；（10）葛根素注射液（2ml：0.1g）：浙江康恩贝制药股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 模型制备：参照文献报道方法 [2～4]。
1.3.2 标本的采集与处理：每组随机抽取6只大鼠均于实验结束相应时间点取材。①取下腔静脉血4ml，每份2ml，其中一份加入促凝管, 3000 g，25℃离心4min, 吸取上层血清常温放置，检测血清心肌酶含量；另一份检测angⅱ含量；②剪取左室前壁ir心肌组织冲洗，分为3块, 其中3块经福尔马林固定、酒精脱水、石蜡包埋后做病理组织切片，光镜下观察组织病理学改变，其余组织用于检测其它指标。
1.3.3 血清心肌酶检测：东芝120fr全自动生化分析仪检测。
1.3.4 心肌梗死范围测定：参照collins等[]方法测定各组心肌梗死范围。
1.3.5 免疫组织化学分析法
（1）实验材料：①免疫组化笔：福州迈新生物技术开发有限公司；②兔抗nf-κbp65多克隆抗体：美国santa cruz sc－109；③羊抗兔maxvisiontm二抗试剂盒(一步法): 福州迈新生物技术开发有限公司； ④dab显色试剂盒：福州迈新生物技术开发有限公司；⑤显微数码成像系统：日本olympus bx－41。按试剂盒说明书操作，显微镜下心肌细胞中棕黄色颗粒为阳性表达，定位于细胞核者为nf-κbp65蛋白活化细胞；（2）心肌组织nf-κbp65蛋白活性检测 ： ①核蛋白提取试剂盒：德国pierce公司 no.78833； ②酶联免疫吸附测定（elisa）试剂盒：美国active motif公司 catalog nos 40096；③准蛋白：美国active motif公司 catalog nos 31102；④考马斯亮兰蛋白测定试剂盒：南京建成生物工程研究所；⑤高速低温离心机：德国eppendorf centrifuge 5810r；⑥雪花机：上海f-m-70；⑦漩涡混匀器 ：北京市六一仪器厂；（3）大鼠心肌组织细胞核蛋白提取：① 心肌组织剪碎后加入适量预冷磷酸盐缓冲液（pbs），匀浆过滤未研磨碎组织，以500 r/min，4℃离心3min，清除上清留下组织细胞； ② 分离约30mg组织加入150μl冰浴的cer1（含蛋白酶抑制剂）；③ 以2 500 r/min涡旋15s，重新悬浮组织团块，冰上孵育10min；④ 加入8.25μl冰浴的cer2；⑤ 以2 500 r/min涡旋5s，冰上孵育1 min；⑥ 2 500 r/min涡旋5s，微量离心机4℃，14 000 g，离心5min；⑦ 弃上清部；⑧ 加入100μl冰浴ner（含蛋白酶抑制剂），以2 500 r/min涡旋15s重新悬浮未溶解组织，冰上冰浴10min，反复冻融，共40min；⑨ 以2 500 r/min涡旋5s，微量离心机4℃，14 000 g，离心10min；⑩ 立即转上清于干净预冷的ep管中，储于-80℃冰箱待用；（4）细胞核蛋白定量 ：按照考马斯亮兰蛋白测定试剂盒说明书操作。
1.3.6 酶联免疫吸附测定（elisa）：检测nf-κbp65蛋白的dna结合活性：按transam nf-κbp65蛋白检测试剂盒说明书操作。
1.3.7 放射免疫分析法测定血浆和心肌组织angⅱ含量：①血浆angⅱ含量测定：放射免疫分析药盒购自北京北方生物技术研究所, sn-682b－3型放射免疫γ－计数器，严格按试剂盒说明书检测样本，试剂盒测定范围10～2000pg/ml，灵敏度5pg/ml，批内变异系数cvw<10%，批间变异系数cvw<15%，与血管紧张素i(ang i)交叉反应率<0 .01%；②心肌组织angⅱ含量测定： 根据文献报道[6]检测样本，同时用考马斯亮兰蛋白测定试剂盒测定对应心肌组织总蛋白含量。最终心肌angⅱ含量pg/100mg 表示。
1.4 统计学分析
采用spss 13.0软件包进行统计分析。两两之间比较采用snk-q检验。计量资料以均数±标准差(±s)表示，p<0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 葛根素预处理对miri大鼠血清心肌酶和心肌梗死范围的影响
与ir组比较，葛根素预处理组的血清肌酸激酶（ck）、肌酸激酶-同功酶（ck-mb）含量明显下降ck（8552.00±47.39）u/l∶（7165.67±83.46）u/l；ck-mb（5071.50±61.54）u/l∶（4226.33±96.11）u/l，p均<0.05；心梗范围明显减少，氯化四唑（ttc）为（43.54±1.10）%∶（40.44±0.73）%，p<0.05。
2.2 葛根素预处理对miri大鼠心肌组织学影响
光镜下葛根素预处理组心肌间质血管扩张充血较ir组明显减轻,肌纤维轻度肿胀,有少量心肌纤维断裂及中性粒细胞浸润。
2.3 葛根素预处理对miri大鼠心肌组织nf-κbp65蛋白激活的影响
较之ir组，葛根素预处理组nf-κbp65的蛋白活性明显受抑（11.93±5.05）ng/μl ∶（8.65±0.24） ng/μl，p<0.01。
2.4 葛根素预处理对miri大鼠血浆及心肌组织angⅱ含量的影响
葛根素预处理组的血浆和心肌组织angⅱ含量虽较假手术组明显增高，但与ir组比较则显著降低（p均<0.05），见表1。表1 葛根素对大鼠血浆及心肌血管紧张素ⅱ（angⅱ）含量的影响注：ir：缺血再灌注。与ir组比较△ p<0.05；与假手术组比较▲p<0.05。
3 讨 论
nf-κb由多个亚单位组成，静息细胞nf-κb的p65亚基与其抑制性蛋白（iκb）结合形成复合体，以非激活的形式存在于胞浆中。细胞刺激后iκb降解，nf-κb从iκb释放，并转移到细胞核，暴露核定位序列，结合到靶基因的启动子或增强子的κb结构域，引起靶基因转录[7]。
nf-κb是参与炎症反应的一个重要转录因子，参与许多基因表达的调控，其激活在多种细胞因子、粘附分子、趋化因子释放中起关键性作用[8]；miri激活nf-κb的可能因素包括氧化应激、复氧、内质网钙离子超载、游离基、no和内毒素等；其可诱导表达细胞间粘附分子（icam）-1、诱导型一氧化氮合成酶（inos）、肿瘤坏死因子（tnf）α和angⅱ 等，进而造成心肌炎症反应、损伤、凋亡和坏死，已发现小鼠胚胎心肌细胞ir模型nf-κbp65与心肌细胞凋亡及坏死有关[9]。
葛根素为豆科多年生落叶藤本植物的干燥根提取物,其有效成份为单体－异黄酮，已知葛根素减轻miri是减少无复流现象、抑制钙超载、减少白细胞损伤、抗自由基等多种机制的共同协调作用的组合[10]，葛根素可抑制过氧化氢诱导的大鼠晶状体上皮细胞中的nf-κb活化表达和抑制iκb的降解及nf-κb活性表达，抑制脑ir后炎症反应[11，12]。葛根素预处理可模拟经典缺血预处理的保护作用而显著减轻大鼠miri，但是否与抑制nf-κb p65蛋白表达并减少循环和局部angⅱ含量而发挥心肌保护作用，尚未见国内外文献报道。
本试验于在体大鼠miri模型上观察了葛根素预处理对心梗面积、心肌酶学及对nf-κbp65蛋白表达的影响，结果显示,较之ir组，葛根素预处理在明显缩小在体大鼠心梗面积和明显降低心肌酶学水平的同时明显抑制nf－κbp65蛋白的dna结合活性，提示葛根素预处理在明显改善心肌损伤程度，能与抑制nf-κbp65蛋白表达相关。
已知葛根素可降低急性心梗患者肾素活性和angⅱ水平[13]。本试验结果进一步显示，葛根素预处理亦显著降低循环及局部的angⅱ含量，推测葛根素预处理此效应可使与血管紧张素受体1（at1r）的angⅱ数量明显减少，从而阻滞at1r导致的炎症性心肌损伤减轻与nf-κb受抑制相关[14]。文献报道angⅱ诱导炎症因子的产生是通过nf-κb依赖途径[15] ；nf-κb也可上调心肌细胞表面的at1r而在心肌重构中发挥作用[16]。组织ras激活后, angⅱ可经过at1-r/nf-κb通路正反馈地进一步刺激血管紧张素原的产生[17]。另有报道葛根素减轻儿茶酚胺诱导的心肌损伤[18]，并从分子水平证明了葛根素为β-受体阻滞剂[19]，故笔者推测葛根素预处理一方面经抑制nf-κbp65蛋白的表达而减少循环及局部的angⅱ含量和/或下调at1r，减轻了在体大鼠miri的炎症反应而呈现心肌保护作用；另一方面减轻心脏交感神经末梢儿茶酚胺递质对β受体激活，此两种作用共同切断了儿茶酚胺与ras相互促进形成的恶性循环，但葛根素预处理是否确实具有类似血管紧张素转换酶抑制剂（acei） 的药理作用，抑制局部组织和循环中 angⅱ生成，尚待进一步研究。
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