【摘要】 目的：观察葛根素对子宫内膜异位症（endometriosis，em）血管形成的影响以及葛根素对em肿瘤相关基因的调控作用。方法：利用子宫内膜细胞原代培养技术、鸡胚绒毛尿囊膜(chicken chorioallantoic membrane，cam)模型、基因芯片等方法，了解em肿瘤相关基因表达的情况，观察葛根素对em血管生成、肿瘤相关基因的调控作用。 结果：葛根素可明显抑制种植内膜组织囊泡及周边血管形成，其血管阳性面积显著小于模型组（p<0.05）。基因芯片结果显示，增殖期em在位内膜组织较之正常在位内膜组织、em异位内膜组织较之em在位内膜组织，在癌基因，抑癌基因，细胞黏附、侵袭、转移、血管生成相关基因及细胞凋亡相关基因表达方面有明显不同。100 μmol/l葛根素可明显上调em在位基质细胞凋亡基因bad、bax、casp8、casp9和tnfrsf6表达，并增强细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子cdkn1b、cdkn2a及ifna1、ifnb1基因表达；减少癌基因fos、chek2、src和黏附侵袭基因itgb5、mmp9及生长、转录因子基因pdgfa、nfkbia表达。结论：葛根素能够抑制异位灶新生血管的形成，减少异位灶的血液供应；通过调整em癌基因、抑癌基因、细胞周期相关因子基因表达，并通过影响凋亡相关基因的表达，促进细胞凋亡，从而改变em内膜细胞类似肿瘤细胞的恶性行为。
【关键词】 子宫内膜异位症; 葛根素; 鸡胚绒毛尿囊膜模型; 基因芯片; 肿瘤相关基因
yu cq, yu j, han j, zhou ql, shen w. j chin integr med. 2009; 7(1): 4147.
received july 10, 2008; accepted september 12, 2008; published online january 15, 2009.
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doi: 10.3736/jcim20090106open access
regulatory mechanism of malignant behavior of endometriosis mediated by puerarin
chaoqin yu1, jin yu2, jie han1, qiaoling zhou1, wei shen3
1. department of traditional chinese medicine, changhai hospital, second military medical university, shanghai 200433, china
2. department of integrated traditional chinese and western medicine, hospital of gynecology and obstetrics, fudan university, shanghai 200011, china
3. department of traditional chinese medicine, changzheng hospital, second military medical university, shanghai 200003, china
objective: to observe the inhibitory effects of puerarin on angiopoiesis of endometriotic tissue, and to explore the regulatory effects of puerarin on tumorrelated gene expression of endometriosis.
methods:the regulatory effects of puerarin on endometriotic angiopoiesis and tumorrelated gene expression were observed by using a chicken chorioallantoic membrane model and gene array method.
results: chicken chorioallantoic membrane experiment indicated that puerarin obviously inhibited endometriotic vasiculation and angiopoiesis. the area of blood vessels was significantly reduced as compared with the untreated group (p<0.05). the expressions of oncogenes and genes related to adhesion, invasion, and apoptosis, including erbb2, ets2, fos, s100a4, tek, tert, nfkbia, cdh1, cd44, itga6, ncam1, mmp1, flt1, akt1, bcl2l and birc5 genes, were obviously higher, while the expressions of the antioncogenes, antiapoptosis genes and antiinvasion genes, including kai1, kiss1, serpinb5, tnfrsf25, tnfrsf1a, tnfrsf6 and serpinb2, were significantly lower in eutopic endometrial tissue from patients with endometriosis than those from endometriosisfree women. the expressions of oncogenes (erbb2, ets2, fos), apoptosis gene (bcl2l1), cyclindependent kinases (cdk4, cdc25a), and growth factor and receptors (hgf, fgfr2, tgfbr) were significantly enhanced, while the expressions of the antioncogenes (kai1, serpinb5), apoptosis genes (bad and tnf) and cyclindependent kinase inhibiting factor (cdkn2a) were obviously reduced in ectopic tissue as compared with those in eutopic tissue from patients with endometriosis. puerarin significantly enhanced the gene expressions in endometriotic stromal cells, including bad, bax, casp8, casp9, tnfrsf6, cdkn1b, cdkn2a, ifna1 and ifnb1, and reduced the gene expressions of fos, chek2, src, itgb5, mmp9, pdgfa and nfkbia.
conclusions: the tumorrelated gene expression has significant differences in eutopic endometrial tissue between patients with endometriosis and endometriosisfree women, and between ectopic and eutopic tissues from patients with endometriosis. puerarin can reduce angiopoiesis, regulate tumorrelated gene expression and facilitate apoptosis in endometriotic tissue.
keywords: endometriosis; puerarin; chick chorioallantoic membrane; gene array; tumor related gene
子宫内膜异位症（endometriosis, em）是具有生长功能的子宫内膜腺体和间质种植于子宫腔以外部位的一种雌激素依赖性疾病。wWw.11665.COM它具有的侵袭性、广泛种植、易复发的特性与恶性肿瘤十分相似。em异位灶的生长除依赖于卵巢产生的雌激素外，还依赖于异位灶自分泌的雌激素。研究表明，异位内膜组织高表达细胞色素芳香化酶p450 mrna和蛋白［1, 2］。细胞色素芳香化酶p450是雄激素转化为雌激素的限速酶和关键酶。
植物性雌激素（phytoestrogens）是植物体内具有弱雌激素作用的化合物，具有抗雌激素作用，抑制细胞色素芳香化酶p450的活性，并对17β羟甾脱氢酶2（17βhydroxysteroid dehydrogenase2, 17βhsd2）有调节作用。植物性雌激素还具有抑制前列腺素合成酶，阻断em异位灶雌激素的自分泌及雌激素前列腺素e2芳香化酶的正反馈作用［3, 4］。
鉴于植物雌激素上述作用特点，我们认为植物雌激素是治疗em十分有潜力的药物。但目前国内外对植物雌激素的研究主要在心血管系统、抗肿瘤和改善更年期症状——骨质疏松等方面，而其治疗em的研究至今国内外尚未见报道。葛根是常用中药，价格低廉。而葛根素是中药葛根的主要有效成分，是一种植物雌激素，其化学成分为异黄酮化合物，因此葛根素可能是治疗子宫内膜异位症的有效药物。本研究利用子宫内膜细胞原代培养、鸡胚尿膜囊（chicken chorioallantoic membrane, cam）模型、基因芯片等技术，探讨葛根素对em血管形成的抑制作用及葛根素对em肿瘤相关基因的调控作用，为临床上的应用奠定基础。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 em在位内膜、异位内膜组织的获取 2002年12月至2005年12月在长海医院妇产科手术的em合并卵巢内膜样囊肿患者26例，年龄23～47岁，平均（38.13±2.78）岁；所有患者均无内科合并症；月经规律，术前3个月内未用过激素类药物治疗。在剖腹行子宫或子宫及附件全切术后，无菌条件下分离子宫内膜、巧克力囊肿内皮以及盆腔异位灶，用于后续实验。
1.1.2 正常对照组在位内膜组织的获取 因子宫肌瘤行子宫全切术的患者10例，年龄36～45岁，平均（42.81±2.58）岁；无内科合并症；术前3个月内未用过激素类药物治疗。均在剖腹行子宫、附件全切术后，无菌条件下刮取子宫内膜，用于后续实验。
1.2 主要试剂 ⅳ型胶原酶(美国sigma公司)，dnaseⅰ酶(华美生物工程有限公司)，海兰白受精鸡胚（上海大江养殖场），葛根素（陕西赛德高科生物股份有限公司，批号20041209），癌通路发现者基因芯片（康成生物工程有限公司），rna酶抑制剂(cat no. n2511)和mmlv逆转录酶(cat. no. m1701)（promega公司），dna聚合酶(cat no. l03)和化学发光检测试剂盒(cat no. d01)（superarray bioscience公司）。
1.3 实验方法
1.3.1 cam造模及药物干预实验 将8日龄鸡胚气室端钻一小孔，穿透气室壳膜。在距胚头前1 cm，两条前卵黄静脉之间的卵壳投影部位开1 cm×1.5 cm的窗。剪除卵壳膜，将5例患者正常子宫内膜组织、3例em患者在位内膜组织及4例em患者异位内膜组织分别剪成2 mm×2 mm大小，将内膜组织置于尿囊膜上的无血管区，制备子宫内膜组织、em在位内膜组织及em异位内膜组织cam模型。将6只em在位内膜组织cam模型及8只em异位内膜组织cam模型随机分为模型组和0.1 mg/ml葛根素组，分别加入含与葛根素等量溶媒二甲基亚砜的100 μl pbs或100 μl 0.1 mg/ml葛根素。灭菌封口胶封住天窗后，置于恒温孵化箱继续孵化72 h。用甲醇/丙酮等体积溶液固定尿囊膜，15 min后剪下尿囊膜，拍照后用图像分析软件分析阳性血管面积，计算阳性血管面积与分析图像总面积之比。
1.3.2 基因芯片比较研究 采集5例因子宫肌瘤行子宫全切术患者的子宫内膜组织、15例em患者在位或异位子宫内膜组织，根据内膜组织质量加入相应量trizol试剂，进行基因芯片比较研究。采集4例em患者在位内膜组织按我们改良的子宫内膜细胞原代培养方法培养子宫内膜基质细胞［5］。将细胞均分入两个50 ml培养瓶中培养，待细胞融合至80%后换培养液，治疗组加入葛根素，终溶度为100 μmol/l；对照组则加入等体积的含与葛根素等量溶媒二甲基亚砜的培养液。48 h后弃培养液，加入相应量trizol试剂。采用trizol一步法提取组织或细胞的总rna，对总rna进行过柱纯化，用分光光度计进行浓度和纯度测定。制备cdna芯片探针，线性聚合酶反应液94 ℃ 2 min变性cdna探针，然后迅速放入冰水中冷却。芯片杂交，化学发光检测。x射线胶片曝光后，将胶片上的附图像用扫描仪扫描并转换为灰度tiff格式文件保存。运行scanalyze软件，将灰度tiff格式附图片的点阵转化为数字型数据，将此原始数据储存为microsoft excel文件。使用芯片配套软件gearray analyzer对原始数据进行去背景计算以及比较运算。每张芯片都含有440个基因，并点有负对照（puc18 dna和空白）和管家基因（包括βactin、甘油醛3磷酸脱氢酶、cyclophilin a和核糖体蛋白l13a）。原始数据首先被减掉背景最小值，继而用管家基因来进行校正，校正后的数据用来进行样品间基因转录的相对丰度分析。
1.4 统计学方法 用spss 11.0统计软件进行统计。单位面积血管百分比法采用配对资料t检验。
2 结 果
2.1 葛根素对子宫内膜组织黏附、侵袭和生长情况的影响 正常在位内膜组织、em异位内膜组织空白组有较大的囊泡形成，周边血管生成明显，而葛根素可明显抑制种植内膜组织囊泡及周边血管形成。见图1。
图1 各组cam种植内膜组织囊泡及周边血管形成情况
figure 1 vesicle and angiopoiesis in implanted endometrial tissue of cam in different groups
a: eutopic endometrium from endometriosisfree women; b: eutopic endometrium from endometriosis women; c: ectopic endometrium from endometriosis women; d: eutopic endometrium treated with puerarin from endometriosisfree women; e: eutopic endometrium treated with puerarin from endometriosis women; f: ectopic endometrium treated with puerarin from endometriosis women.
2.2 葛根素对cam模型边缘血管形成情况的影响 em异位内膜葛根素组血管阳性面积比显著低于模型组（p<0.05）。见表1。表1 各组cam模型血管阳性面积比
2.3 em在位子宫内膜组织与正常对照子宫内膜组织比较表达上调基因 与正常子宫内膜组织比较，em在位子宫内膜组织中表达上调两倍以上的基因有18个。见表2。
2.4 em在位子宫内膜组织与正常对照子宫内膜组织比较表达下调基因 em在位子宫内膜组织与正常对照子宫内膜组织比较，表达下调两倍以上的基因有7个。见表3。
2.5 em异位内膜组织与em在位内膜组织比较上调基因 em异位内膜组织与em在位内膜组织比较，表达上调两倍以上的基因有10个。见表4。
2.6 em异位内膜组织与em在位内膜组织比较表达下调基因 em异位内膜组织与em在位内膜组织比较，表达下调两倍以上的基因有6个。见表5。表2 em在位子宫内膜组织与正常对照子宫内膜组织比较表达上调基因（两倍以上） 表3 em在位子宫内膜组织与正常对照子宫内膜组织比较表达下调基因（两倍以上）表4 em异位内膜组织与em在位内膜组织比较上调基因（两倍以上）表5 em异位内膜组织与em在位内膜组织比较表达下调基因（两倍以上）
2.7 em在位基质细胞葛根素组与em在位基质细胞空白组比较上调基因 em在位基质细胞葛根素组与空白组比较，表达上调两倍以上的基因有10个。见表6。
2.8 em在位基质细胞葛根素组与em在位基质细胞空白组比较下调基因 em在位基质细胞葛根素组与em在位基质细胞空白组比较，表达下调两倍以上的基因有7个。见表7。
表6 em在位基质细胞葛根素组与em在位基质细胞空白组比较上调基因(两倍以上) 表7 em在位基质细胞葛根素组与em在位基质细胞空白组比较下调基因(两倍以上)
3 讨 论
3.1 cam模型在em研究中的价值和葛根素对em在位、异位内膜组织生长及血管形成的影响 cam模型常用于血管生成活性物质或血管生成抑制性物质的筛选［6］。近年来已有作者将其用于观察肿瘤组织或细胞生长情况及相关药物疗效的研究。已有研究表明，em病灶血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial cell growth factor, vegf)表达明显增高，说明局部新生血管生成活跃［7］。为此，我们认为cam可能是药物筛选的理想em模型。本研究将子宫内膜在位或异位组织接种于尿囊膜两条卵黄静脉之间无血管区域，72 h后内膜组织均黏附生长，局部区域形成较大囊泡，周边血管生成明显。其中在位内膜组织较之异位内膜组织囊泡大、囊液多。这可能与在位内膜组织腺上皮细胞丰富，而异位内膜组织腺上皮细胞相对较少有关。无论正常在位内膜种植组织、em在位内膜种植组织和em异位内膜种植组织，葛根素组囊泡小、囊液少；且葛根素组em异位内膜组血管阳性面积比显著低于模型组。说明100 μmol/l葛根素可明显抑制种植内膜组织囊泡及周边血管形成，尤其是对em异位内膜组织。
3.2 正常对照在位内膜组织、em在位内膜组织和em异位内膜组织肿瘤相关基因表达的异同及葛根素的调控作用 em的发病机制目前尚不明晰。koninckx等［8］提出em的起病并不是由于随经血逆流的内膜组织的种植或胚胎间质细胞的化生，而是内膜细胞呈现一种恶性的改变，从而异位的内膜组织细胞得以逃开腹腔液的免疫监视和调节因子的影响，最终由异位内膜组织细胞发展成em。目前有学者提出子宫内膜干细胞假说，随经血逆流的具有分化潜能和自我更新特征的子宫内膜干细胞促使最初异位病灶的产生，维持病灶的存在，并进一步促使病灶的发展［9］。我们对em在位内膜细胞与正常对照在位内膜细胞的形态学进行比较，发现两者形态学相似［10］，但在基因表达方面存在很大差别。增殖期em在位内膜组织较之正常在位内膜组织erbb2、ets2、fos、s100a4、tek、tert和nfkbia等癌基因表达明显增强；与细胞黏附、侵袭、转移和血管生成相关的基因cdh1、cd44、itga6、ncam1、mmp1、flt1及抑制细胞凋亡基因akt1、bcl2l1、birc5表达明显上调；而抑癌基因kai1、kiss1、serpinb5，促凋亡相关基因tnfrsf25、tnfrsf1a、tnfrsf6和抑制侵袭相关基因serpinb2表达明显下降。说明em内膜细胞黏附侵袭、增殖能力增强，细胞凋亡相对减少，从而容易在腹腔内种植、生长。
另一方面，异位内膜组织细胞定居于腹腔后，在腹腔液浸润的特殊微环境中，细胞形态也必定会有相应的改变，基因也将出现有别于在位内膜组织细胞的选择性表达，合成和分泌一些特异蛋白［11, 12］，对em病情的发展起着决定性的作用。我们的研究证实了此点，em异位基质细胞的体积比正常对照细胞、em在位基质细胞小，异染色质增多，核增大，并且其胞膜表面有较多的微绒毛和胞浆突起，细胞胞浆内存在不规则线粒体［10］。这些形态学的改变与癌细胞基本相似，可能与em的恶性行为有关。em异位内膜组织与em在位内膜组织比较，基因表达亦有明显不同，癌基因erbb2、ets2、fos，抑制凋亡基因bcl2l1，细胞周期蛋白依赖性激酶cdk4、cdc25a，生长因子及其受体hgf、fgfr2、tgfbr1基因表达均明显增强；抑癌基因kai1、serpinb5，促凋亡基因bad、tnf，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子cdkn2a基因显著下调。
根据植物雌激素作用特点，葛根素作为一个植物雌激素应是治疗em的有效药物。我们的实验已经表明小剂量的葛根素可明显抑制em异位内膜组织的生长、并可抑制血管形成及异位灶芳香化酶p450的表达，减少异位灶雌激素的自分泌［13］。我们的基因芯片比较研究还发现，100 μmol/l葛根素可明显上调em在位基质细胞凋亡基因bad、bax、casp8、casp9和tnfrsf6表达，并增强细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子cdkn1b、cdkn2a及ifna1和ifnb1基因表达；减少癌基因fos、chek2、src和黏附侵袭基因itgb5、mmp9及生长、转录因子pdgfa、nfkbia表达。
值得注意的是葛根素对凋亡基因的调控作用。细胞凋亡的途径主要有两条，一条是通过胞外信号激活细胞内的凋亡酶caspase；另一条是通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活caspase。胞外信号激活细胞凋亡主要由fas介导。fas配体与fas结合后，引起caspase8、caspase10通过自身剪激活，它们启动caspase的级联反应，使caspase3、caspase6、caspase7激活，这几种caspase可降解胞内结构蛋白和功能蛋白，最终导致细胞凋亡。而线粒体参与的凋亡途径主要由线粒体细胞色素c介导。细胞色素c作为凋亡诱导因子能与抗恶性贫血因子1、caspase9前体、atp/datp形成凋亡体（apoptosome），然后召集并激活caspase3，进而引发caspases级联反应，导致细胞凋亡。bcl2家族成员在线粒体参与的凋亡途径中起调控作用，能控制线粒体中细胞色素c等凋亡因子的释放。根据葛根素对凋亡相关基因表达调控特点，我们认为葛根素可能开启了线粒体参与的凋亡途径，促进em异位基质细胞的凋亡。
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