【关键词】 糖尿病肾病
study on diacylglycerol acyltransferase 1 gene k378n polymorphism in type 2 diabetes mellitus and diabetic nephropathy
【abstract】 aim: to investigate whether diacylglycerol acyltransferase 1 （dgat1） gene k378n polymorphism relates to chinese type 2 diabetes mellitus（t2dm） and diabetic nephropathy （dn）. methods: gene k378n polymorphism in the dgat1 gene was genotyped by templatedirected dyeterminator incorporation with fluorescence polarization (tdifp) in 71 patients with t2dm, including 29 patients with dn (dn＋) and 42 without dn (dn-), and 45 normal controls. results: in the t2dm group, there were 42 carriers of dgat1 kk genotype, 40 of kn genotype and 12 of nn genotype. in the dn＋ group, there were 14 carriers of dgat1 kk genotype, 11 of kn genotype and 4 of nn genotype. in the dn- group, there were 22 carriers of dgat1 kk genotype, 14 of kn genotype and 6 of nn genotype. in the control group, there were 13 carriers of dgat1 kk genotype, 23 of kn genotype and 9 of nn genotype. the frequency of dgat1 k378 allele increased in patients with t2dm but there was no significant difference compared with that in normal controls（p>0.05）. there was no significant difference of dgat1 k378n alleles and genotypes between dn＋ and dn- groups（p>0.05）. conclusion: dgat1 k378n may not be associated with the onset of t2dm or dn in chinese population.
【keywords】 diabetes mellitus, type 2；diabetic nephropathies；polymorphism,single nucleotide；diacylglycerol acyltransferase 1； templatedirected dyeterminator incorporation with fluorescence polarization detection
【摘要】 目的： 探讨二酰基甘油酰基转移酶1（dgat1) k378n基因多态性与中国人2型糖尿病(t2dm)及糖尿病肾病(dn)的关系. 方法： 运用荧光偏振模板依赖的染料掺入反应法（tdifp）技术检测dgat1 k378n基因多态性在71例t2dm患者［29例糖尿病肾病患者（dn＋组）和42例糖尿病非肾病患者（dn－组）］和45例健康对照者中的等位基因和基因型分布频率. 结果：kk，kn和nn基因型在t2dm组的分布分别为：42, 40, 12例；dn＋组：14, 11, 4例；dn－组：22, 14, 6例；正常对照组：13, 23, 9例. ① t2dm患者dgat1 k378等位基因频率(66.0％)高于健康对照组（54.4％），但未达显著性水平；② dn＋组与dn－组k378n等位基因及基因型分布无显著差异（p>0.05）. 结论：k378等位基因频率在t2dm患者组有升高，但未见dgat1 k378n基因多态性与中国人t2dm及dn发生的明显相关关系.
【关键词】 糖尿病，2型；糖尿病肾病；多态性，单核苷酸；二酰基甘油酰基转移酶1；tdifp技术
0引言
二酰基甘油酰基转移酶(dgat)是微粒体酶，催化甘油二酯与脂肪酰基辅酶a以共价健结合，是三酰甘油（tg）合成的限速酶.近来有报道dgat1缺陷小鼠可抵抗饮食诱导的肥胖、提高胰岛素及瘦素敏感性.胰岛素抵抗是2型糖尿病（t2dm）发病的重要原因，而肥胖是t2dm最主要的危险因素之一.dgat1基因可列为t2dm病因学研究的候选基因，我们应用了具有高敏感性和特异性的检测单核苷酸多态性（snps）方法荧光偏振模板依赖的染料掺入反应法（tdifp）［1,2］检测了该基因第378位赖氨酸到天门冬酰胺（k378n）多态性在t2dm患者和健康人中的分布，以明确其与t2dm及dn的关联性.
1材料和方法
1．1材料
1.1.1血样标本2型糖尿病患者（t2dm组）： 94例t2dm患者均系我院内分泌科就诊患者，依1999年世界卫生组织（who）糖尿病诊断标准诊断.按其是否发生肾病并发症分为两组：① 糖尿病肾病组（dn＋组） 29（男15，女14）例，年龄（58.5±7.2）岁，病史5~12 a，多次尿白蛋白阳性，排除感染、高血压引起的尿蛋白. 糖尿病肾病常与糖尿病视网膜病变同时存在，若同时有尿蛋白但无糖尿病视网膜病变，则尿蛋白不能排除为高血压造成，因而该组剔除了有尿蛋白无视网膜病变同时有高血压患者共17例.② 糖尿病非肾病组（dn-组） 42（男20，女22）例，年龄（54.9±10.6）岁，病史3~10 a，尿白蛋白阴性，因有糖尿病视网膜病变多已伴发肾脏改变，可能尚处于病变早期而无临床表现，因而该组剔除了尿白蛋白阴性但同时有糖尿病视网膜等微血管病变患者共6例.健康对照组（control组）：随机取我院体检中心体检健康者45（男21，女24）例，年龄（48.5±13.1）岁，经检查排除糖尿病、高血压、高血脂、冠心病、肥胖及肾病等，且均无糖尿病家族史.采集所有受检对象空腹静脉血样标本，edta抗凝，提取dna，另一管送常规生化检验.
1.1.2主要试剂及仪器dntp，taq dna聚合酶、pgemt easy载体系统购自promega公司.核酸外切酶i、虾碱性磷酸酶、acyclodna聚合酶和荧光偏振检测仪victor2购自perkinelmer公司.荧光标记终止子acycloterminatorstm （acyclogtpr110/acycloctptamra）为perkinelmer公司专利产品.dna引物5′cacaccccacctacctgatgc3′及5′cctgggggctgggatgg3′；探针5′cttctggcagaactggaa3′由上海博亚生物技术有限公司合成.
1.2方法
1.2.1dna引物及探针设计根据引物设计的基本原则，应用dnastar软件，结合tdifp反应的特殊要求设计引物及探针.引物与探针序列不能重叠，探针的3′末端必须紧邻待测变异基因位点.特异性寡核苷酸探针及与变异碱基对应互补末端掺入的特异碱基gtp/ctp是基于dgat1基因扩增片段内的序列及变异碱基设计的，扩增靶片段长度为140 bp（fig 1）.
1.2.2dna的提取及pcr扩增用标准酚/氯仿法由周围血白细胞内提取基因组dna.取dna模板5 μl，dntp 150 μmol/l，引物各0.25 μmol/l，mgcl2 2.0 mmol/l, taq dna聚合酶16.67 nkat，反应体系共25 μl.pcr条件：95℃ 4 min；94℃ 30 s，52℃ 40 s，72℃ 30 s，40个循环；72℃ 5 min，扩增靶片段dna.标本dna经扩增后所得产物用20 g/l琼脂糖凝胶电泳检测.将经回收、连接、转化、筛选、测序正确的发生和未发生变异的质粒dna作为阳性和阴性标准品.
1.2.3dgat1 k378n基因多态性的检测鉴定采用tdifp方法对扩增产物中k378n变异碱基进行检测.首先消化处理：虾碱性磷酸酶和核酸外切酶ⅰ混合物与pcr产物37℃孵育2 h，可分别降解pcr产物中残余的dntps和引物，避免对后续反应的干扰；而后80℃热处理15 min灭活酶.以此产物为模板与探针结合，再以acyclogtpr110和acycloctptamra这两种荧光标记终止子为底物，在acyclodna聚合酶及其缓冲液中于95℃ 2 min, 然后95℃ 15 s，50℃ 30 s，25个循环杂交延伸, 最后15℃延伸10 min，4℃保存. pcr产物模板与探针互补杂交，与模板互补的游离荧光标记终止子acyclog/ctp掺入到探针末端，荧光素分子量增加，在荧光偏振检测仪上分别检测acyclogtpr110（波长535 nm）和acycloctptamra（波长595 nm）的荧光偏振（fp）值, 据两种荧光的fp值, 推断变异碱基类型.
统计学处理： 正态分布资料用x±s表示，各组间基因型及等位基因频率比较采用χ2检验，组间均数比较采用t检验（方差不齐时用t′检验）或方差分析，疾病危险因素分析采用二分类logistic回归，整个统计分析用ssps 11.0软件处理.
2结果
2.1临床特征dn＋组和dn－与正常对照组
的性别（sex）、年龄(age)、体质指数bmi，均无显著差异(p>0.05)，dn＋组和dn－的收缩压(sbp)及舒张压(dbp)水平高于正常对照组(p<0.05)，并且dn+组收缩压高于dn－组(p<0.05, tab 1).表1各组临床特征比较（略）
2.2生化特征dn＋组和dn－与正常对照组的血胆固醇(chol)、高密度脂蛋白（hdl）等均无显著差异(p>0.05)， dn＋组和dn－组的tg水平高于正常对照组(p<0.05, tab 2).表2各组生化指标特征比较（略）
2.3反应体系及引物测试pcr扩增所有标本基因组dna中dgat1基因目的片断, 显示扩增片段长度为140 bp, 无非特异扩增条带，与预期相符.
2.4tdifp方法检测pcr扩增产物消化后，与dgat1基因特异探针及两种荧光标记碱基混合反应，acycloctptamra掺入，tamra fp值增高，对应n378等位基因；acyclogtpr110掺入，r110 fp值增高，对应k378等位基因；两者都有掺入时，为杂和基因型.dn+，dn-，t2dm，正常对照组基因型及等位基因频率经χ2检验符合hardyweinberg遗传平衡定律(p>0.05)，样本具有群体代表性. ① t2dm患者dgat1 k378等位基因频率(66.0％)与健康对照组（54.4％）比较未达显著性水平（χ2=3.432, p=0.064, tab 3). ② dn＋组与dn－组的k378n等位基因频率及基因型频率无显著差异（p>0.05,tab 4).表3t2dm组与正常对照组等位基因及基因型频率比较（略）表4dn+组和dn-组等位基因及基因型频率比较（略）
2.5用logistic回归进行疾病危险因素分析以是否有t2dm为因变量进行logistic回归分析， sbp（p=0.000），tg（p=0.003）进入方程，提示sbp（or=1.122，95％ci: 1.055～1.193）, tg升高（or=6.532，95％ci:1.923～22.185）是t2dm发生的危险因素.
3讨论
dgat是tg合成的限速酶，包括dgat1和dgat2两种. dgat1的表达广泛，在肾上腺皮质髓质、睾丸、小肠高表达，在甲状腺、胃、心、骨骼肌、肝中等量表达，而dgat2表达较受限制［3］.已发现dgat1缺陷小鼠可通过增加能量消耗抵抗饮食诱导的肥胖，组织tg水平降低，胰岛素及瘦素敏感性提高［4］.而过表达dgat的胰岛β细胞在高糖水平下培养72 h后，糖刺激的胰岛素分泌明显受损［5］. dgat被认为与胰岛素抵抗密切相关，抑制该酶可能是治疗肥胖及糖尿病的新靶点.还有报道过表达dgat1可减少信号脂质(dag、磷脂酶c、磷脂酶a2和膜脂质）而合成tg，调节膜脂质和信号脂质的合成，因而在调节细胞生长方面有重要作用［6］.
snps被目前认为是疾病临床表现的遗传基础.snps的研究热点是启动子区的snps和csnps即及蛋白质编码区域内的snps.csnps又分同义csnps和非同义csnps.非同义csnps指碱基序列的改变可使以其为模板翻译的蛋白质序列发生改变，从而可能影响蛋白质的功能，这种改变常是导致生物性状改变的直接原因.已有报道dgat1基因启动子c97t变异与土耳其女性低体质量指数、高hdlch及低dbp有关［7］.但coudreau等［8］研究则认为该变异与法国人肥胖无关. dgat1基因snps变异与糖尿病关系尚未见报道.我们检索了美国国家生物技术信息中心entrez的snp数据库，检索到该基因的一个csnps变异k378n并进行了病例对照研究，t2dm患者dgat1 k378等位基因频率(66.0％)高于健康对照组（54.4％），虽未达显著性水平；但不能否认该基因与糖尿病可能存在关联.催化同样反应的dgat2，与dgat1分属于不同的基因家族［9］，是否会补偿由于dgat1 k378n基因多态性造成的异常.这有待dgat1及dgat2各自功能的进一步阐明，以及基因变异与酶活性间的对应关系的研究.另外可能受到该基因其他多态性位点的影响，如与c97t变异有无交互作用存在.
本研究还显示dn＋组与dn－组k378n等位基因频率及基因型频率无显著差异，dgat1基因多态性与糖尿病肾病发生无关.logistic回归结果提示tg及sbp为糖尿病的危险因素，因此可以从对tg代谢或对sbp有影响的众多候选基因中进行多基因筛查，这将有助于糖尿病遗传学的探索.
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