【关键词】 人免疫缺陷病毒反式激活蛋白 蛋白转导 药物治疗
人类免疫缺陷病毒1型 (hiv1)基因能够编码一种被称为反式转录激活因子 (transactivator of transcription，tat)的蛋白。它通过与反式激活应答(transactivating response，tar)rna序列结合以起始基因转录。tat蛋白和rev蛋白一起作为hiv1的调控因子，在hiv的基因表达中起着举足轻重的作用。研究发现，tat蛋白能够穿过细胞膜［1,2］，到达细胞外，具有细胞膜穿透肽(cellmembrane penetrating peptide，cpp)活性，其穿膜序列由11个氨基酸组成。这一特性具有非常重要的应用价值，因为它提供了一条转运其他蛋白或药物穿过细胞膜，进入细胞的途径。通过设计编码穿膜序列和其他蛋白的融合基因，表达后获得的融合蛋白，在tat的引领下可以进入细胞。
本文就tat蛋白的生物学作用及其近年来的研究进展作一综述。
1 tat蛋白结构
tat蛋白的基因包含2个外显子和一个含2 334个核苷酸的内含子组成。在hiv1的各亚型中，tat蛋白的氨基酸组成有所不同。在hiv1 (hxb2)中，tat蛋白由86个氨基酸组成；而在hiv1 (consensus b)中，tat蛋白由101个氨基酸组成。WWW.11665.COm按照结构和功能的不同可以将tat蛋白划分为5个区：①酸性n末端区(121)；②半胱氨酸(cys)富积区 (22-37)，含有7个cys，这在hiv各亚型中高度保守；③核心区(38-48)，含有rkglgi基序；④基本区(49-72)，具有rkkrrqrrr基序，并且具有tar rna结合活性；⑤细胞黏附的c-末端区(73-101)，含有rgd基序，tat通过rgd基序与细胞整合素结合。
vive等［3］发现，tat蛋白中具有穿膜功能的序列是位于47～57的11个氨基酸(ygrkkrrqrrr)，富含碱性氨基酸(8个)，被称为蛋白转导域 (protein transduction domain，ptd)。为了更好地了解tat蛋白的功能，加拿大manitoba大学的shojania等［4］ 采用15n和13c标记tat(1-72)蛋白，并通过核磁共振 (nuclear magnetic resonance，nmr)对其结构进行了分析。此富含半胱氨酸的蛋白在ph4.1时被还原，nmr化学位移和耦合常数表明它是以无规则卷曲的形式存在，半胱氨酸富含区和核心区的谱线增宽并出现多峰，提示有的结构域出现了瞬时折叠。通过nmr弛豫参量，光谱密度和lipariszabo方法进行的分析都表明整个分子中没有特定的结构，是一种天然未折叠蛋白 (natively unfolded protein)。这与它能跟多种蛋白及核酸相互作用的功能相一致。
2 tat蛋白在hiv引起的疾病中的作用
tat蛋白作为一个反式激活作用因子，在hiv1基因复制过程中起重要作用，其基本区和核心区在反式激活作用中起关键作用。tat蛋白还可以在转录水平上调节宿主细胞的功能，它还能表现出许多生物学活性：诱导血管形成，单核细胞的趋化性及炎症细胞因子如il1，il6和tnfα等的分泌。tat蛋白还可以促进来源于单核细胞的树突状细胞成熟，增强其功能和抗原特异性t细胞反应。此外，tat蛋白还有其他重要的生物学功能，艾滋病患者常伴发其他疾病，如卡波济肉瘤、神经疾病等，可能与tat蛋白有关。
2.1 tat蛋白加快卡波济肉瘤的发病过程
卡波济肉瘤 (kaposi′s sarcoma，ks)是由卡波济肉瘤相关疱疹病毒(sarcomaassociated herpesvirus，kshv或hhv8)引起的。在艾滋病流行以前，ks主要见于意大利人和犹太人的老年男性中，而且肿瘤生长缓慢。而在艾滋病患者中，肿瘤生长迅速，并扩展到肺、胃肠道及其他器官中。
研究表明，tat蛋白是卡波济肉瘤发病过程中的一个重要因子。tat蛋白与感染有kshv的bcbl1细胞系共培养，发现tat蛋白可以诱导kshv基因转录产生裂解期mrna并表达产生蛋白质。表明tat蛋白通过诱导kshv复制，增加kshv病毒数量来参与ks发病过程［5］。
2.2 tat蛋白的神经毒性
tat 蛋白与hiv1引发的神经损伤有关，表现出神经毒性。tat蛋白与甲基苯丙胺(meth)协同作用可以使纹状体多巴胺能神经末梢变性，使多巴胺和多巴胺转运蛋白减少，引起基底神经节结构的损伤，tnfα参与这一过程［6］。
aprea等［7］对tat引起的神经元损伤和细胞死亡的分子机制进行了研究。tat蛋白与大鼠胚胎皮质神经元作用后，可以引起微管相关蛋白2 (microtubuleassociated protein 2，map2)快速降解及细胞骨架微丝的塌陷。这与观察到的神经机能异常的aids患者脑内map2缺失以及神经元损伤一致。
基质金属蛋白酶 (matrix metalloproteinase，mmp)是一类结构相似、含锌的内肽酶，可以降解胞外基质蛋白，也能破坏血脑屏障和神经突触。它可以降解tat蛋白，调节其神经毒性和转录活性［8］。tat蛋白、mmp与人胎儿神经元共孵育后，通过测定线粒体膜电势的变化及神经元死亡情况，发现神经毒性显著降低。而mmp抑制剂可以阻断这一效果。细胞中mmp对tat蛋白的水解作用，被认为是宿主的一种独特的先天性免疫机制。
hiv感染患者脑部出现淀粉样沉积物，脑啡肽酶 (neprilysin)是脑部淀粉样肽链主要的降解酶。daily等［9］发现源自tat的多肽可以抑制脑啡肽酶，使之失活，从而出现淀粉样沉淀物。研究表明tat蛋白本身并不能抑制脑啡肽酶，起作用的是来自其半胱氨酸富含区的多肽。
tat蛋白表现出神经毒性的机制可能包括与整合素受体结合，诱导氧化应力，造成线粒体损伤，启动炎症级联反应［10］。也有研究表明，tat蛋白可以与星形胶质细胞、小胶质细胞及脑水皮细胞作用增加诱导型nos的表达，释放no［11］。
2.3 tat蛋白与家族性原发性肺动脉高压
家族性原发性肺动脉高压 (familial primary pulmonary hypertension，fpph)与上皮细胞和巨噬细胞表面的骨形态发生蛋白受体2 (bone morphogenetic protein receptor，bmpr2)基因突变相关。bmpr2是介导骨形态发生蛋白信号的受体，属于转化生长因子β受体（transforming growth factorβreceptor，tgfβr)家族成员。在fpph患者中发现，tat蛋白能够抑制巨噬细胞的基因转录。
将bmpr2启动子转染进入巨噬细胞系u937，观察tat蛋白对其表达的影响。结果表明tat蛋白可以下调bmpr2的表达并抑制其功能［12］，tat蛋白定位在bmpr2启动子的起始208 bp上。tat蛋白可能是fpph的一个致病因子。
2.4 tat蛋白引起的免疫应答
kittiworakarn 等［13］ 发现tat蛋白可以作为自佐剂(autoadjuvant)而引起免疫应答。他们合成了一系列的tat101系列物，发现在balb/c小鼠中可以诱导抗体反应，在swiss杂种小鼠体内也发现抗tat抗体反应，这表明这种自佐剂现象并不局限于特定的遗传背景。此外，体外注射tat101系列物还能得到能够分泌il2的特异th细胞。这些现象表明tat101在没有佐剂的情况下，能够引发小鼠体液免疫反应。进一步研究发现，控制自佐剂现象的核心区域位于氨基末端区以及半胱氨酸富集区。引发这种抗体反应的主要分子事件是半胱氨酸介导的寡聚化，cys34残基的氧化形成的tat二聚体可以使抗体反应增强。
3 tat蛋白穿膜序列的应用
tat蛋白具有穿膜功能，其ptd能够与其他大分子物质，如蛋白等一起穿膜进入细胞。利用这一性质可以将体内不能正常合成的蛋白酶通过这一途径转导进入细胞，使之发挥生物学作用。delom等［14］首次发现tat蛋白能够转导外源蛋白进入秀丽隐杆线虫 (caenorhabditis elegans)的肠上皮细胞。这说明ptd的跨膜功能不具有物种特异性。近几年来，tat蛋白的ptd受到越来越广泛的重视，许多科学家都在利用其穿膜功能从事相关研究。
3.1 国外在tat穿膜序列应用方面的进展
链霉亲合素 (streptavidin，sa)是一个四聚体蛋白质，能够与生物素特异结合。将其与tat蛋白融合，得到融合蛋白tatsa，用来转运生物素化的药物或其他物质进入细胞。albarran 等［15］用生物素化的碱性磷酸酶与tatsa结合后，通过荧光激活细胞分选 (fluorescent activated cell sorting，facs)分析和共聚焦显微镜鉴定表明碱性磷酸酶在tat介导下进入到了细胞内，而且保持了原有的生物学活性。同时发现，融合蛋白进入细胞是通过内化作用，即静电介导的细胞表面吸附，然后形成囊泡，进入细胞。这为分子转运进入细胞提供了一条新途径，可以使之生物素化，然后通过与tatsa结合进入细胞，将来可能会有更大的应用。
米屋西林 (myocilin)是glc1a基因的表达产物，是一种酸性蛋白，分布于睫状体长足细胞和基底细胞，与光感受器细胞的纤毛相连。它属于细胞骨架蛋白，参与纤毛样神经上皮(如光感受器)的形态发生。米屋西林与青少年原发性开角青光眼的发病相关，在许多青光眼患者中都发现该基因突变。sakai 等［16］ 实验表达了带血细胞凝集素 (hemoagglutinin，ha)标签的tat与米屋西林的融合蛋白tathamyocilin，并将其转导进入人及牛的小梁网中。通过体外细胞培养、组织培养和器官培养发现，tathamyocilin可以进入小梁网细胞、小梁组织及牛眼中。通过tat蛋白介导米屋西林进入小梁网组织中，可以进一步研究该蛋白在青光眼的发病过程中的作用。
嘌呤核苷磷酸化酶 （purine nucleoside phosphorylase， pnp)功能受损会引起核苷酸稳态失衡、t细胞免疫严重缺陷及神经机能损伤和神经细胞死亡。对于pnp缺陷病，现在还没有有效的治疗措施。pnp是一个细胞内酶，将外源pnp转运进入细胞内不失为一个好的治疗办法。toro 等［17］融合了tat蛋白与pnp，得到tat－pnp。将其注射到pnp缺陷型小鼠体内后，观察长期活性的变化。tatpnp可以进入各种组织，包括脑，而且能够免受抗体中和，不会通过尿液排泄，在体内表现出很好的生物学活性。24周后，还能表现出生物学活性。多次注射可以校正代谢不良及免疫缺陷，没有表现出明显的毒性。这些结果进一步证明，tat蛋白可以作为载体介导药物进入细胞内用于治疗一些疾病。
tara 等［18］将ptd与抗细胞死亡蛋白（fnk）重组并转导进入骨髓单核细胞(bone marrow mononuclear cell，bmmnc)中，观察其是否会抑制细胞死亡并提高将其移植到缺血区的效率。实验结果表明，转导有ptdfnk的骨髓单核细胞可以更好地存活并保持分化为内皮祖细胞（endothelial progenitor cell，epc）的潜能。当将表达egfp的骨髓单核细胞移植到大鼠的缺血区后发现，用ptdfnk处理的骨髓单核细胞能够更有效地整合到血管中，还保持着生成血管的潜能。ptdfnk可以显著地提高骨髓单核细胞移植到缺血区的效率。
3.2 国内在tat穿膜序列应用方面的进展
局部缺血性脑损伤常常伴随着细胞中钙离子浓度升高。钙离子拮抗剂在动物模型中可以降低钙离子浓度，但在临床实验中没有取得成功。国内复旦大学的fan等［19］将ptd与钙结合蛋白d 28k (cabd)通过大肠杆菌重组在一起，将其转导进入细胞中，发现可以使细胞中的钙离子浓度降低，维持钙离子稳态。ptd介导的蛋白转导可能成为治疗脑损伤的有效方法。
军事医学科学院的wu等 ［20］将ptd与酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，th）基因在pet载体中融合并在e.coli bl21中表达, 以检测其对6羟基多巴胺（6ohda）引起的帕金森病（parkinson′s disease, pd）的治疗情况。体外实验表明ptdth重组蛋白可以有效地进入到人神经母细胞瘤中，大鼠体内实验表明该蛋白可以透过血脑屏障进入到纹状体及中脑。对功能的测定证实其可以缓解6ohda引起的症状。ptd介导的人酪氨酸羟化酶有可能成为治疗帕金森病的新方向。
4 总 结
ptd具有广泛的应用，从理论上讲它可以将任何蛋白转导进细胞中去，可以用于治疗一些由于蛋白缺陷等引起的疾病。在实际应用中可能并不是想象中的那么简单，有时会得不到预期的结果。在实验过程中应警惕假阳性结果的出现。andrade等［21］将tatptd与半胱氨酸蛋白酶抑制剂b (cystatin b, cstb)融合以研究其对癫痫症的治疗效果，发现tatptdcstb并不能穿过细胞膜进入细胞。对于tat蛋白ptd的穿膜机制还需要进一步深入研究，使之更好地为人类服务。
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