esfatin1对脑干孤束核葡萄糖敏感神经元电活动影响
【关键词】 nesfatin1;孤束核;神经元;葡萄糖;膜片钳术
【摘要】 目的 观察nesfatin1对脑干孤束核葡萄糖敏感神经元电活动影响，探讨其抑制摄食作用的可能机制。方法 采用全细胞膜片钳技术，在电流钳下，记录nesfatin1对孤束核葡萄糖敏感神经元电活动的影响。结果在孤束核中共记录到30个神经元，给予葡萄糖(5 mmol/l)灌流后，有18个(60.0%)对葡萄糖有反应，其中13个放电频率升高(gexc,t=2.509,p<0.05)，5个放电频率下降(ginh,t=12.79,p<0.01)，其余12个无反应。在13个gexc神经元，灌流nesfatin1 (10 nmol/l)后12个放电频率增加(t=3.346,p<0.01)，1个无反应。在5个ginh神经元，灌流nesfatin1 (10 nmol/l)后4个放电频率减少(t=11.877,p<0.01)，1个无反应。 结论nesfatin1能够调制孤束核葡萄糖敏感神经元的兴奋性，这可能是nesfatin1作用于孤束核抑制摄食的机制之一。
【关键词】 nesfatin1;孤束核;神经元;葡萄糖;膜片钳术
nesfatin1 influences electric activity of glucosesensitive neurones in nucleus of solitary tract song wenke, jiang zhengyao (department of physiology, qingdao university medical college, qingdao 266071, china); [abstract] objective to observe the effects of nesfatin1 on glucosesensitive neurons in nucleus tractus solitarius(nts), and explore the possible mechanisms of nts in controlling food intake. methods wholecell patchclamp technique was used to record the discharges of nts induced by nesfatin1 administration. results thirty nts neurons were treated with glucose, of which 18 (60.0%) responded to glucose with 13 as glucoseexcited (gexc) neurons and five as glucoseinhibited (ginh) neurons. the other 12 showed no response. nesfatin1 administration (10 nmol/l) increased the firing rates of 12 gexc neurons (12/13) (t=3.346,p<0.01), but decreased the firing rates of four ginh neurons (4/5) (t=11.877,p<0.01). one was found with no response. conclusion nesfatin1 can regulate the activity of gexc neurons, which might be one of the mechanisms of nts controlling food intake.
[key words] nesfatin1; solitary nucleus; neurons; glucose; patchclamp technique
nesfatin1是由日本群马大学森昌朋教授等于2006年发现的摄食调节肽[1]，大鼠脑室内注射nesfatin1能抑制摄食，nesfatin1通过阿片促黑色素细胞皮质素原(pomc)途径发挥抑制摄食的作用。WwW.11665.cOm我们以前研究了ⅰ、ⅱ型糖尿病病人空腹血浆nesfatin1的水平，结果显示ⅰ型糖尿病病人空腹血浆nesfatin1水平略高于正常人，但差异无统计学意义;ⅱ型糖尿病病人空腹血浆nesfatin1水平则均明显低于正常人和ⅰ型糖尿病病人[2]。脑干孤束核(nts)含有葡萄糖敏感神经元[3]，其中包括葡萄糖兴奋型神经元(gexc)和葡萄糖抑制型神经元(ginh)。许多研究证明，nts葡萄糖敏感神经元参与摄食的调控。 最近, maejima等[4]报道第三脑室注射 nesfatin1诱发的cfos的表达主要位于室旁核和nts。这种选择性的cfos表达，提示除室旁核之外，nts也是nesfatin1抑制摄食的重要靶点之一。本实验采用全细胞膜片钳技术，通过观察nesfatin1对nts葡萄糖敏感神经元的放电活动的影响，探讨nesfatin1在脑干nts抑制摄食的可能机制。
1 材料和方法
1.1 实验材料
出生14 d的健康sd大鼠，体质量30～40 g，雌雄各半，由青岛市药检所提供。记录电极所用硬质玻璃毛坯由sutter instrument co(北京总代理)提供，氯化钠(nacl)、氯化钾(kcl)、氯化钙(cacl2)、硫酸镁(mgso4)、碳酸氢钠(nahco3)、磷酸二氢钠(nah2po4)均系amresco公司产品，葡萄糖(glucose)、葡萄糖酸钾(kgluconate)、四乙酸(egta)、羟乙基哌嗪磺酸(hepes)、gtp、na2atp均为sigma公司产品。
1.2 溶液的配制
按文献[8]方法配制细胞外液和内液。细胞外液(即人工脑脊液， acsf)的成分为：124 mmol/l nacl，3 mmol/l kcl，1.3 mmol/l nah2po4，26 mmol/l nahco3，5 mmol/l hepes，2 mmol/l cacl2，1 mmol/l mgso4，10 mmol/l glucose，用1 mmol/l的naoh调节ph值至7.35～7.45。电极内液配方:130 mmol/l kgluconate，10 mmol/l kcl，1 mmol/l mgcl2，1 mmol/l cacl2，10 mmol/l hepes，1 mmol/l egta，4 mmol/l na2atp，0.5 mmol/l gtp，用1 mmol/l的naoh调节ph值至7.35～7.45。4 ℃冰箱保存备用。
1.3 实验方法
1.3.1 大鼠脑干nts脑片制作 大鼠乙醚麻醉后，迅速断头，剪开头皮，去除颅骨，于含体积分数0.95 o2和0.05 co2冰冷的acsf中取下脑干组织块，放于浸有acsf的滤纸上将脑干修块，然后同琼脂块一起用502胶水粘在切片槽的固定位置。槽中含有冰冷的acsf (0 ℃左右)，并不断通入含体积分数0.95 o2和0.05 co2的混合气体。使用振动切片机(world precision instrument)切出含有nts在内的250 μm厚的冠状切片，置于含体积分数0.95 o2和0.05 co2混合气体的acsf (33 ℃)中孵育1～2 h。
1.3.2 脑片固定与灌流 将脑片移至记录用灌流槽内，采用盖网固定法，即将稀疏的尼龙丝附着在铂金丝制成的u形框架上制成盖网轻覆于脑片，使脑片固定。使用恒流泵(hl2)持续向脑片浴槽中灌注含体积分数为0.95 o2和0.05 co2饱和气体的acsf，流量为2～3 ml/min，脑片浸没于液面下1～2 mm。给予药物时适当调节灌流速度，室温保持在24～26 ℃。
1.3.3 全细胞膜片钳记录 按常规全细胞膜片钳模式记录神经元, 当记录到nts神经元自发放电并稳定后开始实验。首先记录一段自发放电(通常为4～5 min)作为对照，然后灌流含葡萄糖(5 mmol/l)的acsf 5 min，接着用正常acsf冲洗。按文献[5]方法，将给予葡萄糖前后放电频率改变超过20%的神经元鉴定为葡萄糖敏感神经元。如果遇到对葡萄糖有反应的细胞，即待冲洗恢复后给予含nesfatin1(10 nmol/l)的acsf 5 min。将给予葡萄糖或nesfatin1前后放电频率变化超过20%的神经元列入统计。
1.3.4 检验电极记录位置 每次实验，将电极封接神经元位置进行观察并拍照，按照paxionswatson图谱进行核对，观察电极记录位置，位置不准确的资料不列入统计。
1.3.5 数据采集 实验中所有电刺激均从胞体内给予，模拟数字转换器采样频率10 khz，低通滤波频率3 khz;数据采集、记录采用heka实验室提供软件igor pro 501进行。
1.4 统计学处理
应用ppms 1.5[6]及spss统计学软件进行数据处理，结果以±s表示，数据间比较采用t检验。
2 结 果
2.1 nts葡萄糖敏感神经元的鉴定
实验共记录到30个具有自发放电的神经元，灌流含葡萄糖(5 mmol/l)的acsf后，其中13个神经元(43.3%)放电频率明显增高，其平均放电频率从(0.63±0.2)hz增加到(1.73±0.52)hz(t=2.509,p<0.05)，用acsf冲洗后恢复，即鉴定为gexc(图1);12个神经元(40.0%)无明显反应;5个神经元(16.7%)放电频率明显减少, 其平均放电频率由(2.74±0.08)hz减少到(0.63±0.18)hz(t=12.79,p<0.01)，此即ginh(图2)。
2.2 nesfatin1对葡萄糖敏感神经元放电活动影响
在nts的13个gexc神经元中，灌流nesfatin1后发生兴奋反应的有12个(92.3%)，平均放电频率由(1.24±0.40)hz增加到(3.40±0.82)hz(t=3.346,p<0.01)(图1)，无反应的1个。在5个ginh神经元中，灌流nesfatin1后表现为抑制反应的有4个(80.0%)，其平均放电频率由(2.67±0.41)hz减少到(0.71±0.14)hz(t=11.877,p<0.01)，无反应的1个(图2)。
3 讨 论
关于摄食、能量平衡调控的机制十分复杂，许多肽类如促进摄食的orexin、神经肽y(npy)、刺鼠相关蛋白(agrp)，抑制摄食的leptin、黑色胞刺激素(αmsh)等都参与其中，相互协调、相互影响，从而使机体得以维持自身的能量稳定，进而将体质量严格控制在一个很小的波动范围内。nts是内脏传入神经进入中枢的门户，从胃肠道传来的感觉信号由迷走传入纤维首先在nts进行整合。
葡萄糖敏感神经元广泛地分布于下丘脑的多个核团，其中包括下丘脑弓状核(arc)、下丘脑外侧区(lha)、腹内侧核(vmn)和室旁核(pvn)，同时在脑干的nts等与摄食调节密切相关的区域也有分布，这些神经元可感知细胞周围葡萄糖浓度的变化, 启动或终止摄食行为，以维持机体能量平衡。
maejima等[4]报道第三脑室注射nesfatin1诱发cfos的表达主要位于室旁核和nts。这种选择性的cfos表达，提示除了室旁核之外，nts也是nesfatin1抑制摄食的重要靶点之一。形态学研究结果已证明,下丘脑pvn催产素神经元发出下行纤维支配nts[7]。shimizu等[8]报道，在小鼠腹腔注射nesfatin1，除显著抑制摄食之外，其诱发cfos的表达只出现在nts和最后区，而不出现在下丘脑arc，表明腹腔注射nesfatin1主要激活nts和最后区的神经元。本实验观察到，经全细胞膜片钳给予nesfatin1可以直接调制nts葡萄糖敏感神经元的兴奋性。ritter等[9]研究表明，nts葡萄糖敏感神经元属于脑干儿茶酚胺能a2细胞群。另外， bonnet等[10]研究表明，nts的nesfatin1神经元是酪氨酸羟化酶阳性的儿茶酚胺能神经元。因此，我们有理由推测，本实验记录的葡萄糖敏感神经元可能是nesfatin1神经元。nesfatin1可以调节nts葡萄糖感受神经元的兴奋性，显著改变其自发放电的频率，这也许可能是nesfatin1在nts 抑制摄食的部分机制之一。
综上所述，nesfatin1可以调制nts葡萄糖敏感神经元的兴奋性，这为nesfatin1在nts 抑制摄食提供了电生理学的依据。
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