作者：李宝莉，陈雅慧，张正祥，符兆英，袁秉祥
【摘要】 目的观察酸枣仁油、栀子油组成的复方酸枣仁油栀子油促进学习记忆作用和二药的相互作用。方法采用避暗、跳台、水迷宫实验，分别利用东莨菪碱、环己酰亚胺、亚硝酸钠、4.282mol/l乙醇造成小鼠的记忆获得、巩固、再现障碍，观察复方酸枣仁油栀子油对正常及记忆障碍小鼠的学习记忆作用。结果对正常和记忆损伤小鼠，复方酸枣仁油栀子油、酸枣仁油、栀子油能缩短训练时入室潜伏期、减少入室错误次数;能延长训练后入室潜伏期、减少入室错误次数，减少跳台错误次数;也能缩短水迷宫实验小鼠的登台潜伏期，增加其穿越次数，复方中剂量缩短小鼠登台潜伏期较酸枣仁油、栀子油作用强。结论复方酸枣仁油栀子油、酸枣仁油、栀子油具有促进学习记忆作用;复方中酸枣仁油、栀子油起协同作用。
【关键词】 复方酸枣仁油栀子油;酸枣仁油;栀子油;学习记忆
abstract: objectiveto observe the effects of compound jujube seed oil and gardenia oil in improving learning and memory in mice as well as the interaction between jujube seed oil and gardenia oil.methodsscopolamine, cycloheximide, sodium nitrite and ethanol were utilized to study the acquisition, consolidation and retrieval processes of memory in mice by the step-through test, step-down test and morris water maze test, and to observe the effects of jujube seed oil and gardenia oil compound on learning and memory in mice.resultsin normal mice and memory-damaged mice, the jujube seed oil, gardenia oil and their compound all could shorten delitescence of training, reduce error number times of training errors, extend delitescence of post-training by the step-through test, reduce error number of post-training by the step-through and step-down tests, shorten the delitescence of upper platform and increase passing-through number by morris water maze test. the compound shortened the delitescence of upper platform better than either of the two oils.conclusionthe compound jujube seed oil and gardenia oil can promote learning and memory in mice, and the two oils in combination show an obvious synergistic effect.
key words: compound jujube seed oil and gardenia oil; jujube seed oil; gardenia oil; learning and memory
学习记忆是大脑最基本也是最重要的高级神经功能，既是认知活动的组成部分，也是重要的智力因素。Www.11665.cOm学习主要是指人或动物通过神经系统接受外界环境信息而影响自身行为的过程;记忆是指获得的信息或经验在脑内贮存和提取(再现)的神经活动过程[1]。酸枣仁为鼠李科(rhamnaceae)植物酸枣[ziziphus jujuba mill. var. spinosa (bunge)hu ex h.f.chow]的干燥成熟种子。甘酸性平，善养肝血，益心阴而宁心安神。栀子为茜草科植物栀子(gardenia jasminoides ellis)的干燥成熟果实。栀子苦寒，清热泻火，凉血解毒，擅入心经，长于清心透邪，除烦解郁而安神定志。二药合用，为治血虚阴亏、热扰神明而致心烦失眠之常用药对。对复方酸枣仁油栀子油的镇静催眠抗惊厥作用已有报道[2]。本文主要观察其促学习记忆作用。
1材料与统计
1.1药品与试剂超临界co2萃取的酸枣仁油(jujube seed oil, jso)、栀子油[3](gardenia oil, go)由第四军医大学药物研究所制备，按2∶1[4]配伍成复方酸枣仁油栀子油(compound jujube seed oil and gardenia oil, cjgo)，批号：260515;氢溴酸东莨菪碱(scopolamine hydrobromide)，徐州莱恩药业有限公司产品，批号：0311181;环己米特(环己酰亚胺，cycloheximide)，sigma公司产品;亚硝酸钠(sodium nitrite)，上海之臻化工有限公司产品，批号：060104;乙醇(ethanol)，西安化学试剂厂，批号：051024。
1.2仪器避暗、跳台两用仪为西安交通大学医学院设备科制造;mt-200morris水迷宫视频跟踪系统为成都泰盟科技有限公司制造。
1.3动物昆明种icr小鼠，♀，陕医动字第08-004，二级合格动物，体重18～22g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。
1.4统计学处理实验数据以±s表示。显著性检验采用spss16.0统计分析软件，计量资料的方差分析采用univariate组间lsd-t检验/tamhane-t′检验的两两比较;部分指标选用非参数k independent samples(kruskal-wallis h)检验。对水迷宫重复测量数据进行一般线性模型(general linear model, glm)的repeated measures和multivariate，用repeated measures单变量方差分析lsd-t检验，实现每组在各时间点上的两两比较;用multivariate多元方差分析lsd-t检验，实现各时间点上组间的两两比较[5]。p<0.05判定为有显著性差异。
2方法与结果
实验分4批进行，每批随机分为复方大(5.4g/kg)、中(2.7g/kg)、小(1.35g/kg)剂量组，酸枣仁油组1.8g/kg，栀子油组0.9g/kg，均用生理盐水稀释至6ml/kg灌胃给药，模型组、正常组给予等容积生理盐水，每组10只。各组小鼠每天上午9∶00给药1次，连续给药15d。第16天上午给药1h后开始避暗、跳台和水迷宫训练并测定[6]。
2.1复方酸枣仁油栀子油对记忆获得障碍模型小鼠学习记忆的影响第16天上午给药1h后，除正常对照组腹腔注射生理盐水外，其余各组均依次腹腔注射
1.5mg/kg东莨菪碱溶液造成记忆获得障碍模型。10min后，开始训练并测定各组小鼠的入室潜伏期和5min内错误次数。15min后，测定5min内小鼠跳下安全台的错误次数。24h后，在与训练日相同的时段再次测试，记录各组小鼠的入室潜伏期和5min内入室错误次数以及小鼠第一次跳下安全台的潜伏期和3min内错跳次数(表1、表2)。表1复方酸枣仁油栀子油对记忆获得障碍模型小鼠学习记忆(避暗法)的影响 表2复方酸枣仁油栀子油对记忆获得障碍模型小鼠学习记忆(跳台法)的影响结果表明：对于记忆获得障碍模型小鼠，复方酸枣仁油栀子油能明显缩短训练时小鼠入暗室的潜伏期，并减少入室错误次数;也能明显延长训练后小鼠入暗室的潜伏期并减少入室错误次数;减少训练后跳台错误次数。酸枣仁油、栀子油也可减少训练时、训练后小鼠的入室错误次数;延长训练后入室潜伏期，减少跳台错误次数。说明复方酸枣仁油栀子油、酸枣仁油、栀子油对记忆获得障碍模型小鼠的学习记忆有促进作用。
2.2复方酸枣仁油栀子油对记忆巩固障碍模型小鼠学习记忆的影响第16天上午给药1h后，于训练后除正常对照组腹腔注射生理盐水外，其余各组均立即腹腔注射120mg/kg环己酰亚胺溶液造成记忆巩固障碍模型。24h后，在与训练日相同的时段再次测试，记录各组小鼠的入室潜伏期和5min内电击次数以及小鼠第一次跳下安全台的潜伏期和3min内错误次数。结果显示：复方酸枣仁油栀子油能明显减少训练时正常小鼠的入室错误次数;能延长训练后记忆巩固障碍模型小鼠的入室潜伏期，明显减少入室错误次数;减少训练后跳台错误次数。酸枣仁油、栀子油对训练时、训练后的正常和记忆障碍小鼠均可减少其入室错误次数。说明复方酸枣仁油栀子油、酸枣仁油、栀子油能改善正常和记忆巩固障碍小鼠的学习记忆能力(表3、表4)。表3复方酸枣仁油栀子油对记忆巩固障碍模型小鼠学习记忆(避暗法)的影响表4复方酸枣仁油栀子油对记忆巩固障碍模型小鼠学习记忆(跳台法)的影响
2.3复方酸枣仁油栀子油对记忆再现障碍模型小鼠学习记忆的影响第16天上午给药1h后开始训练并测定。24h后，在与训练日相同的时段，除正常对照组灌胃给予生理盐水外，其余各组均灌胃给予4.282mol/l乙醇溶液10ml/kg造成记忆再现障碍模型。30min后，再次测试并记录各组小鼠的入室潜伏期和5min内电击次数以及小鼠第一次跳下安全台的潜伏期和3min内错误次数(表5、表6)。表5复方酸枣仁油栀子油对记忆再现障碍模型小鼠学习记忆(避暗法)的影响表6复方酸枣仁油栀子油对记忆再现障碍模型小鼠学习记忆(跳台法)的影响结果显示：复方酸枣仁油栀子油能缩短训练时正常小鼠的入室潜伏期，减少入室错误次数，并能减少训练时跳台错误次数;能够明显延长训练后记忆再现障碍模型小鼠入室潜伏期及减少入室错误次数;减少训练后跳台错误次数。酸枣仁油、栀子油也可减少训练时正常小鼠的入室潜伏期及入室错误次数;减少训练后记忆障碍小鼠跳台错误次数。说明复方酸枣仁油栀子油、酸枣仁油、栀子油能改善正常和记忆再现障碍小鼠的学习记忆能力。
2.4复方酸枣仁油栀子油对记忆障碍模型小鼠学习记忆(水迷宫法)的影响
第16天给药1h后开始morris水迷宫训练。将水池等分为4个象限，分别称为sw、nw、se及ne象限,在sw象限正中离池壁33cm处放一个直径10cm、高15cm的平台，平台顶低于水面1cm。迷宫上方安置带有显示系统的摄像机,同步记录小鼠的运动轨迹。每只动物每天训练4次，训练期间迷宫外参照物保持不变。每天将小鼠从不同入水点背对站台放入水池,并记录小鼠自入水到找到站台所需的时间，称为潜伏期。用于测量小鼠空间学习和记忆的能力。找到后在平台上保持15s，如1min内找不到，引导到平台上，保持15s。连续训练4d，最后1d训练后除正常对照组腹腔注射生理盐水外，其余各组均立即皮下注射亚硝酸钠120mg/kg，第20天给药1h后进行行为测试。实验开始将站台的位置转移到另一个象限中进行站台迁移试验。记录潜伏期，然后把站台去掉，记录2min内小鼠穿越站台位点的次数，记为穿越次数。用于测量小鼠学会寻找平台后，对平台位置的记忆能力。实验发现复方酸枣仁油栀子油于训练第2天(给药第17天)即可缩短正常小鼠的潜伏期，随着训练天数的增加缩短作用更加明显;而酸枣仁油于训练第3天(给药第18天)方可缩短正常小鼠的潜伏期，随着训练天数的增加缩短作用越加明显;用亚硝酸钠制备记忆巩固障碍后，仍可发现复方酸枣仁油栀子油缩短记忆障碍小鼠的潜伏期，增加其穿越次数;酸枣仁油、栀子油也可缩短记忆障碍小鼠的登台潜伏期;组方中以复方中剂量作用为佳，于给药第19、20天复方中剂量缩短小鼠潜伏期较酸枣仁油、栀子油有显著性意义，即ab>a，ab>b。说明复方酸枣仁油栀子油、酸枣仁油、栀子油有促进正常及记忆障碍小鼠的学习记忆能力;复方中酸枣仁油与栀子油在学习记忆方面有协同作用[7](表7)。表7复方酸枣仁油栀子油对记忆障碍模型小鼠学习记忆(水迷宫法)的影响
3讨论
采用避暗、跳台、morris水迷宫实验法，给予东莨菪碱、环己米特(环己酰亚胺)、亚硝酸钠、乙醇等公认的记忆障碍工具药[6]，分别造成小鼠获得、巩固和再现性记忆缺损模型，发现复方酸枣仁油栀子油能减少正常小鼠入室错误次数。对记忆获得、巩固、再现障碍模型小鼠训练时的入暗室潜伏期都有缩短作用，减少入室错误次数及错误跳台次数;对训练后的入暗室潜伏期有延长作用，也可减少训练后的入室错误次数及错误跳台次数。酸枣仁油、栀子油也可减少训练时、训练后记忆障碍模型小鼠的入室错误次数;延长训练后入室潜伏期，减少跳台错误次数。复方酸枣仁油栀子油、酸枣仁油、栀子油还可缩短水迷宫实验正常及记忆损伤小鼠的潜伏期，增加其穿越次数。因此，复方酸枣仁油栀子油对正常和记忆缺损小鼠的学习记忆功能均有改善和提高作用;酸枣仁油、栀子油对记忆缺损小鼠的学习记忆功能也有改善和提高作用;酸枣仁油与栀子油在学习记忆方面有相加或协同作用，表明该复方配伍合理。
以上作用可能与酸枣仁油、栀子油含有多种植物脂肪酸有关。超临界co2萃取的酸枣仁油、栀子油的组成较为单纯，主要含油酸、亚油酸[8-10]。亚油酸在体内可转化成亚麻酸、花生四烯酸等。油酸可在体内酰化生成油酰胺，已知油酰胺具有影响学习记忆的作用[11]。
花生四烯酸是人体中含量最高、分布最广的一种多不饱和脂肪酸。在维持膜的物理特性和功能方面起着非常重要的作用。花生四烯酸还参与神经内分泌，调节多种激素和神经肽如加压素的分泌。现已发现花生四烯酸的代谢产物——加压素可提高长时学习记忆功能[12-13]。 酸枣仁油、栀子油组成的复方产生促学习记忆作用，对于该复方的作用机制，目前尚不清楚，有待进一步研究。
近年来，随着人们对植物脂肪酸越来越多地关注，对植物脂肪酸有效成分的提取、在生物体内的转化、生物学效应、作用靶点以及信号转导等纵深方面的研究，为植物脂肪酸的综合开发和利用，提供了非常广阔的应用前景。
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