作者：张茹，成红学，吴海琴，王虎清，郭荷娜
【摘要】 目的观察葛根素对大鼠局灶性脑缺血海马神经元神经型一氧化氮合酶(nnos)表达的影响。方法局灶性脑缺血模型由线栓法阻塞大鼠大脑中动脉制成，葛根素腹腔注射干预治疗，采用氯化三苯基四氮唑染色方法测定脑梗死体积，免疫组织化学方法测定大鼠脑缺血后不同时间点前后海马区nnos阳性神经元表达的变化。结果2h和12h干预组脑梗死体积明显小于对照组(p<0.05)，24h干预组与对照组比较无统计学差异(p>0.05)。缺血2h组海马nnos阳性细胞开始增加，12h组最高，24h组较前有所下降;干预组大鼠海马nnos阳性细胞数与对照组比较降低明显，有统计学差异(p<0.01)。结论nnos参与早期脑缺血损伤，葛根素通过抑制nnos表达对大鼠脑神经元损伤起保护作用。
【关键词】 大鼠;葛根素;脑缺血损伤;神经型一氧化氮合酶;海马
abstract: objectiveto observe the effect of puerarin on the expression of neuronal nitric oxide synthase (nnos) in hippocampal neurons after focal cerebral ischemia in rats.methodsthe model of focal cerebral ischemia was established by achieving middle cerebral artery occlusion in rats with thread. the rats were divided into different ischemia time groups, including 2 hour, 12 hour and 24 hour ischemic models and the control. puerarin was injected intraperitoneally into the models. the volume of cerebral infarction was determined by tripheye tetrazolium chloride (ttc) staining. the expression of nnos-positive neurons in the hippocampus was determined by immunohistochemistry.resultsthe cerebral infarction volume in 2-hour and 12-hour puerarin intervention groups was significantly smaller than that of the control (p<0.05), but there was no difference between the 24 hour ischemic model and the control (p>0.05). the number of nnos-positive cells in the hippocampus started to increase in the 2-hour ischemic rats, and reached the peak in the 12-hour ischemic rats. the nnos-positive cells in the puerarin-therapy rats decreased significantly (p<0.01) compared with those in the controls.conclusionnnos is involved in the early ischemic brain injury. puerarin may protect the brain neurons from ischemic injury by inhibiting the expression of nnos in the neurons.
key words: rat; puerarin; cerebral ischemic injury; nitric oxide synthase; hippocampus
神经型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase, nnos)主要存在于神经细胞，生理状态下活性很低，一旦被激活，则可持续产生大量一氧化氮(nitric oxide, no)，参与脑缺血的病理损伤过程[1]。WWW.11665.COm葛根素是从葛根中提取的一种异黄酮类化合物，具有扩张冠状动脉和脑血管，改善微循环，抗氧化、清除自由基和对缺血损伤保护等作用[2]。已有研究发现葛根素对中枢神经元的缺血损伤有保护作用。但是，其脑保护作用机制是否有nnos的参与尚不明确。本实验在建立大鼠大脑中动脉梗死局灶性脑缺血模型的基础上，采用免疫组化方法测定缺血后海马区不同时间段nnos表达的变化，并阐明葛根素是否对nnos有抑制作用，以进一步探讨其脑保护机制。
1材料与方法
1.1主要试剂和仪器葛根素购自陕西安康正大制药厂。兔抗大鼠nnos多克隆抗体购自武汉博士德，sabc试剂盒和dab显色试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。应用leicu-2045德国产石蜡切片机，应用德国leica图像信号采集与分析系统。
1.2实验动物与分组清洁级健康雄性sd大鼠105只，鼠龄2～3月，体重250～300g，购自西安交通大学医学院实验动物中心。随机分为3组：模型干预组(n=45)、模型对照组(n=45)和假手术组(n=15)。模型干预组及对照组根据干预时间不同又分为2h组、12h组、24h组，每组15只。各模型干预组分别于分组对应的时间点给予一次性葛根素注射液(100mg/kg)腹腔注射，各模型对照组及假手术组给予等量生理盐水腹腔注射。
1.3脑缺血模型的制备参照zea-longar[3]和koizumi[4]的插线方法，略加改良。应用100ml/l的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，线栓的制作选市售标准尼龙渔线，直径规格为0.24～0.26mm，头部沾上清漆约0.5cm，使其头部略粗且光滑，晾干后酒精清洁，临用前置肝素中浸泡10min。从左侧颈总动脉插入，进入长度约为18～20mm，略感阻力即停止进线，从而制造左侧大脑中动脉供血区完全性局灶性脑缺血模型。记录线栓时间，均为持续栓塞。模型成功标准：①右侧肢体疼痛回缩迟钝或消失;②提尾倒悬时右上肢向胸前屈曲;③行走时右侧倾倒或向右转圈。模型干预组及对照组均建成模型，假手术组除不插入线栓外，其余操作同上。
1.4氯化三苯基四氮唑标本的制备与分析给药5h后，将大鼠麻醉迅速断头，剥离大脑。生理盐水冲洗片刻，-20℃速冻5min，然后弃去小脑和延髓，将脑从额极向后连续冠状切面，每2mm一张。放入10g/l氯化三苯基四氮唑(tripheye tetrazolium chloride, ttc)中，37℃摇晃恒温孵育30min，0.1mol/l磷酸盐酸缓冲溶液冲洗2～3次。然后用40g/l多聚甲醛溶液固定24h。将固定的脑片按切片顺序排列，拍照后扫描输入计算机。用图像处理软件计算每一脑片白色区域的面积及红色区域的面积，乘以厚度(2mm)并将所得数值相加得相应的体积。
1.5取材与制片给药5h后，以100ml/l水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，进行心内穿刺灌注固定，先用约250ml室温肝素盐水快速灌注，继之以4℃ 40g/l多聚甲醛300ml缓慢灌注固定1h。立刻断头取脑，沿视交叉冠状位切取大脑组织并分离小脑组织，将其置于40g/l多聚甲醛缓冲固定液12h，固定，随后梯度酒精脱水、石蜡包埋，制作石蜡切片(片厚7μm)。石蜡切片经水浴烫片，贴在预先以多聚赖氨酸处理的载玻片上，60℃ 1h，37℃烘箱过夜。分别行he染色、免疫组化染色。
1.6免疫组织化学检测nnos阳性细胞石蜡切片常规脱蜡，30ml/l h2o2室温孵育40min阻断内源性过氧化物酶，热抗原修复10min，室温冷却2h，正常山羊血清封闭20min，滴加一抗兔抗大鼠nnos多克隆抗体(工作浓度为1∶100)，4℃冰箱过夜，生物素化二抗室温孵育40min，滴加磷酸盐酸缓冲溶液工作液，37℃孵育20min，dab显色5min，苏木素复染，脱水、透明、封片、磷酸盐酸缓冲液分别代替一抗经上述步骤染色作空白对照。
1.7nnos阳性细胞的图像分析光学显微镜下观察大鼠海马ca1区所有nnos阳性神经元，以细胞内出现棕黄色颗粒为阳性细胞，每张切片高倍镜(10×40)下随机选择5个不同的视野，图像信号采集与分析系统拍照，采用自带图像分析软件计数每个视野中阳性细胞数，取其平均值。
1.8统计学分析实验数据用spss13.0统计软件进行分析，所有数据以均值±标准差(±s)表示，检验方法采用单因素方差分析，其中两两比较采用lsd检验。p<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1脑梗死体积的比较干预组和对照组正常组织被染成红色，梗死灶呈苍白色，从而确定脑梗死范围并得到其梗死体积;假手术组脑组织被染成红色，无苍白色的梗死灶。2h干预组和12h干预组脑梗死体积明显小于对照组(p<0.05)，24h干预组与对照组比较，梗死体积的变化没有统计学差异(p>0.05，表1)。表1各组大鼠脑梗死体积的比较
2.2各组he染色的病理特点光镜下观察假手术组海马ca1区神经元排列整齐，核膜清楚，核仁明显，未见神经变性、坏死等病理改变。对照组海马ca1区神经元分布不均，可见胞体皱缩，胞质浓缩，核固缩深染。干预组海马ca1区神经元形态介于上述两组之间(图1)。
2.3各组海马ca1区nnos阳性细胞数的比较镜下观察见假手术组海马锥体细胞层有散在分布的nnos阳性细胞，以胞质染色为主。对照组及干预组均见散在分布的nnos阳性细胞(图2)，且阳性细胞数均增加，12h组表达最高，24h组较12h组有所下降，各组与假手术组比较有统计学差异(p<0.01)。干预组海马ca1区阳性细胞数与对照组比较均明显下降，与对照组比较有统计学差异(p<0.01，表2)。表2各组大鼠海马ca1区nnos阳性细胞数的比较与对照组各相应时间点相比，*p<0.01;与假手术组相比，δp<0.01。图1不同组海马ca1区he染色的病理改变fig.1 histopathological changes of ca1 hippocampal neurons in different groups (he, ×400)a：假手术组;b：2h对照组;c：2h干预组。〖2〗a：假手术组; b：2h对照组;c：12h对照组;d：24h对照组;e：2h干预组;f：12h干预组;g：24h干预组。图2海马ca1区的nnos阳性细胞的免疫组化染色fig.2 the nnos-positive cells in the hippocampus ca1(×400)
3讨论
no以l-精氨酸为底物，在nos催化作用下生成，是一种重要的信使分子，参与多种疾病的病理生理过程。no在中枢神经系统中具有两重作用[5]：一方面具有神经介质传递信息的作用和血管扩张作用，另一方面具有神经毒性作用。nnos主要存在于神经细胞，尤其是小脑神经元中，脑缺血后过度表达的nnos在神经细胞早期损伤中起关键作用[6]，其损伤机制可能是nnos表达上调，产生大量no，进而产生大量自由基，损伤线粒体及dna，诱导细胞凋亡，产生神经毒性作用[6]。因此，nnos及no在脑缺血中的作用越来越受到关注。
本实验选择对脑缺血相对较敏感的海马区，观察脑缺血后海马ca1区nnos表达的变化，发现缺血2h组nnos表达升高，12h组进一步升高，24h组较前下降，与假手术组相比有统计学差异(p<0.01)，提示nnos介导脑缺血早期的损伤，并表现为先升高、后有所下降的趋势。杨卫忠等[7]研究显示nnos mrna在缺血0.5～6h呈高表达，nnos基因在脑缺血早期表达，nnos主要在神经细胞胞质中表达，脑缺血发生后即有短暂的no增高，主要由神经元的nnos及血管内皮的nnos介导。国外学者用免疫组化的方法检查大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型缺血部位见nnos的神经元数量在4h增至高峰，24h开始减退，约7d后回到缺血前水平[8]。而在长时间的脑缺血模型中，也可检测到nnos mrna表达的增加[9]。脑缺血后期nnos活性的下降与快速升高的no有关。no可以使nnos中巯基亚硝基化，导致nnos活性下降。
葛根素是从葛根中提取的一种异黄酮类化合物，对脑缺血性损伤具有较好的脑保护作用。我们先前的实验亦证明葛根素可提高缺血脑组织细胞内氧浓度达到脑保护作用[10]。本实验结果表明，12h内给予葛根素干预能够明显减小脑梗死体积，24h后葛根素干预脑梗死体积虽有所减小。但是，与模型对照组相比无统计学差异。神经保护的主要目的是挽救缺血半暗带，如果半暗带区域的神经细胞得到救治，梗死区域将不会扩大。由此我们可以推测脑梗死后早期应用葛根素能够挽救缺血半暗带内的细胞，从而明显地减少梗死体积，起到神经保护作用。
本实验结果表明，应用葛根素后海马ca1区nnos表达减少，提示葛根素可能通过抑制海马nnos的表达，对脑组织起保护作用。nnos的波动将引起细胞内no的波动;而王姿颖等[11]和谭军等[12]均报道在大鼠模型中可见葛根素通过降低缺血再灌注区脑组织no的含量而对缺血再灌注脑损伤发挥保护作用。因此，葛根素干预后细胞内nnos表达的抑制应是其脑保护的一重要机制。但是，它究竟是通过何种途径减少nnos的表达，从而拮抗no的毒性作用，尚需进一步研究。
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