作者：刘昀，李家芝，张德信，李维，方萍，
徐晶，卢家美，张永红，谢新铭，孙秀珍，李满祥
【摘要】 目的探讨骨髓间质干细胞携带的血红素加氧酶-1(ho-1)基因于体外共培养体系中抑制肺动脉平滑肌细胞增殖的效果及机制。方法采用核转染技术将ho-1质粒转染至骨髓间质干细胞，共培养肺动脉平滑肌细胞和骨髓间质干细胞，评估5-羟色胺刺激后的平滑肌细胞增殖情况，检测5-羟色胺刺激后平滑肌细胞中rhoa的活性。结果5-羟色胺可刺激肺动脉平滑肌细胞增殖，使单纯培养的平滑肌细胞总数较对照组增加2.40倍(p<0.01)。野生型骨髓间质干细胞与肺动脉平滑肌细胞共培养并不能抑制平滑肌细胞的增殖，而携带ho-1基因的干细胞则可明显抑制5-羟色胺刺激的平滑肌细胞增殖，使平滑肌细胞总数降至对照组的1.56倍(p<0.05);5-羟色胺可引起肺动脉平滑肌细胞中rhoa活性增加2.90倍，野生型干细胞与肺动脉平滑肌细胞共培养并未能改变5-羟色胺刺激的rhoa激活，但在携带ho-1基因的干细胞共培养体系中5-羟色胺诱发的rhoa活性明显降低。wWw.11665.COm结论骨髓间质干细胞携带的ho-1基因可以旁分泌的形式抑制平滑肌细胞的增殖，其作用的机制可能与其产生的co通过激活cgmp信号通路进而抑制rhoa的激活有关。ho-1可作为外源基因导入体内治疗肺动脉高压。
【关键词】 骨髓间质干细胞;血红素氧合酶-1;肺动脉平滑肌细胞;细胞增殖;rhoa;肺动脉高压
abstract: objectiveto investigate the inhibitory effects and potential mechanisms of bone marrow mesenchymal stem cells transfected with ho-1 gene on the proliferation of co-cultured pulmonary artery smooth muscle cells.methodsbone marrow mesenchymal stem cells were transfected with ho-1 plasmid using nucleofection and co-cultured with pulmonary artery smooth muscle cells. the proliferation and activation of rhoa of smooth muscle cells in response to serotoin were examined.resultsserotonin resulted in a 2.4 fold-increase in the proliferation of pulmonary artery smooth muscle cells (p<0.01 vs. the control). co-culture of wild type mesenchymal stem cells did not affect the proliferation of smooth muscle cells in response to serotonin, while mesenchymal stem cells with over-expression of ho-1 gene significantly inhibited the proliferation of smooth muscle cells, which declined to 1.56 fold-increase over that of the control (p<0.05). serotonin caused a 2.9 fold-increase in the proliferation and activation of rhoa of pulmonary artery smooth muscle cells. co-culture of wild type mesenchyma stem cells did not alter the proliferation and activation of rhoa in response to serotoin. bone marrow mesenchymal stem cells with over-expression of ho-1 gene significantly inhibited the proliferation of pulmonary artery smooth muscle cells in response to serotoin in co-culture.conclusionour study suggests that transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells modified with ho-1 gene is an effective way of suppressing the proliferation of smooth muscle cells via paracrine secretion manner. the mechanism of ho-1 may be related to its inhibiting activation of rhoa through producing co which can activate cgmp signaling pathway. therefore, it may be used as an exogenic gene in treatment of pulmonary artery hypertension.
key words: bone marrow mesenchymal stem cell; ho-1; pulmonary artery smooth muscle cell; cell proliferation; rhoa; pulmonary artery hypertension
慢性缺氧性呼吸系统疾病，如慢性阻塞性肺病、肺间质性纤维化等引起的继发性肺动脉高压是一种常见的临床综合征，可导致右心衰竭[1]。肺动脉高压及其诱发的右心衰竭是上述慢性缺氧性疾病住院及死亡的主要原因之一[2]。以肺动脉平滑肌细胞增殖为主要特征的肺血管重塑在肺动脉高压的发生中起着关键性的作用，而目前尚无安全有效的抑制肺血管平滑肌细胞增殖的药物[3]。
最近的研究提示，肺动脉高压患者外周血中内皮祖细胞数量减少或功能受损[4-5]，骨髓间质干细胞移植可修复损伤的肺血管内皮细胞，重建肺脏微循环，预防及治疗动物模型中肺动脉高压的发生，提高右心功能[6]。同期的研究亦发现，血红素加氧酶-1(ho-1)具有抗炎及抑制细胞增殖的作用，ho-1转基因动物可表现出对缺氧诱发的肺动脉高压的抵抗性[7]。若能以ho-1基因预先修饰骨髓间质干细胞，再移植入动物或患者体内，必将起到协同作用，能更有效地治疗及预防肺动脉高压的发生。本研究采用体外共培养技术，观察骨髓间质干细胞所携带的ho-1基因的表达产物能否以旁分泌的形式抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖，为基因/干细胞治疗肺动脉高压提供理论基础。
1材料与方法
1.1细胞培养
1.1.1原代肺动脉平滑肌细胞的分离及培养采用golovina的方法获取肺动脉平滑肌细胞[8]：将sprague-dawley大鼠(125～250g)置于密闭的容器内，通入co2使大鼠窒息死亡，无菌条件下取出肺动脉，以含1.5g/l胶原酶(worthington)的hanks液培养肺动脉段20min，显微镜下解剖去除血管外膜和内皮层，于37℃下将平滑肌细胞层在含1.5g/l胶原酶和0.5g/l弹性蛋白酶(sigma)的溶液中继续培养45min，将离心收集的细胞培养于含100ml/l胎牛血清(fbs)的dmem完全培养基中(含100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素)，以0.5g/l胰酶/edta消化细胞传代，取4～8代的细胞进行实验。细胞经4，6-diamidino-2-phenylindole (dapi, invitrogen)和fitc标记的抗平滑肌细胞肌动蛋白抗体(sigma)检测，证实血管平滑肌细胞的阳性率大于93%。
1.1.2骨髓间质干细胞的分离培养无菌条件下取出经
co2窒息处死的sd大鼠的股骨和胫骨，放入含200ml/l fbs、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素、250ng/ml两性霉素b及2mmol/l谷氨酸盐的dmem培养基中，移除骨头的两端，用注射器冲洗出骨髓细胞，用70nm的尼龙滤网过滤冲洗出的骨髓细胞。将细胞培养于75cm2的培养瓶中，2～3d换1次培养基，去除未贴壁的细胞，贴壁细胞则为骨髓间质干细胞。以0.5g/l的胰酶/edta消化细胞后传代扩增干细胞，取2～3代的细胞进行实验。
1.1.3共培养肺动脉平滑肌细胞和骨髓间质干细胞
将1×105野生型或ho-1质粒转染24h后的骨髓间质干细胞接种于0.4μm孔径大小的细胞培养盒中(cell culture inserts, bd bioscience)，再将此盒放入含0.5～1×105肺动脉平滑肌细胞的6孔培养板中，在含20ml/l fbs的dmem培养基中共同培养12h(平滑肌细胞预先给予12h无血清饥饿)，随后以1μmol/l 5-羟色胺刺激平滑肌细胞36h后计数细胞总数，评估平滑肌细胞的增殖。
1.2质粒转染骨髓间质干细胞采用核转染技术将ho-1质粒转染至骨髓间质干细胞。将100μl的细胞悬液与不同剂量的质粒(5μl)混合后移入amaxa公司的转染容器内，以a27程序转染细胞。待转染完毕后立即加入500μl 预热的生长培养基，并轻轻将细胞移入小离心管内于培养箱内培养5min。再将细胞移入培养皿中继续培养。48h后提取细胞总蛋白质以免疫印迹法检测ho-1的表达。
1.3免疫印迹以ripa 裂解液破碎培养的骨髓间质干细胞，
4℃、13000r/min离心10min，收取上清液为细胞总蛋白。以bca试剂盒(pierce)测定蛋白浓度，将等量的蛋白上样于sds-page胶，电泳后转至硝酸纤维素膜。以抗ho-1和gapdh的鼠抗单克隆抗体作为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠igg作为二抗，检测ho-1和gapdh的蛋白水平。将纤维素膜与west pico(pierce)化学荧光底物进行反应，曝光于放射性敏感的胶片，将底片扫描后用scion nih图像处理软件定量分析免疫印迹的强度。
1.4细胞计数将骨髓间质干细胞和肺动脉平滑肌细胞共培养48h后，胰酶消化细胞，将经4，6-diamidino-2-phenylindole(dapi, invitrogen)和fitc标记的抗平滑肌细胞肌动蛋白抗体(sigma)检测证实为平滑肌细胞的细胞进行计数，以评估细胞增殖程度。并以台盼蓝拒染率测定细胞的活性。
1.5rhoa活性的检测以rho活性测量试剂盒(millipore)检测rhoa的活性。共培养的细胞经12h培养后加入1μmol/l 5-羟色胺刺激平滑肌细胞10min。细胞以冰pbs清洗2次，用试剂盒中提供的细胞裂解液破碎细胞并提取蛋白质，以bca蛋白试剂盒(pierce)测量蛋白的浓度。以gst-rhotekin rho结合域沉降活性rho(gtp结合的rho)，样品经sds-page电泳再转至硝酸纤维素膜，以抗rhoa的抗体检测沉降物中活性rhoa的含量。
1.6统计学分析采用 spss13.0软件包进行数据分析。实验数据以均数±标准差表示,计量资料组间比较采用单因素方差分析(one-way anova)，组间多重比较采用tukey post hoc检验。p<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1ho-1在骨髓间质干细胞中的表达ho-1为诱导型ho，其在正常组织细胞中的表达很低或不表达。以含ho-1质粒转染培养的骨髓间质干细胞48h，然后提取细胞的总蛋白，免疫印迹法证实ho-1质粒转染剂量依赖性地增加ho-1的表达(图1)，提示这种转染方法可有效促进质粒dna进入干细胞并在其中表达外源性蛋白质。图1ho-1 质粒转染剂量依赖性地增加ho-1蛋白的表达fig.1 ho-1 plasmid transfection in bone marrow mesenchymal stem cells dose-dependently increased ho-1 protein expression (n=3 in each group)与对照组相比，*p<0.01。
2.2表达ho-1的干细胞抑制共培养体系中肺动脉平滑肌细胞的增殖为明确骨髓间质干细胞所携带的ho-1基因表达产物能否抑制共培养的肺动脉平滑肌细胞的增殖，观察了5-羟色胺刺激的共培养体系中肺动脉平滑肌细胞的增殖。结果显示，在单一平滑肌细胞培养或野生型骨髓间质干细胞与平滑肌细胞的共培养体系中，平滑肌细胞经5-羟色胺刺激36h后细胞总数较对照组(无5-羟色胺刺激)分别增加了2.40或2.20倍(p<0.01)，但在表达ho-1的干细胞共培养体系中，相同浓度的5-羟色胺仅增加了1.56倍的平滑肌细胞总数(p<0.05，与野生型干细胞共培养体系相比)。同时，台盼蓝拒染率显示存活细胞大于97%。提示干细胞所携带的ho-1可以旁分泌的形式明显抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖(图2)。图2携带ho-1基因的骨髓间质干细胞抑制共培养体系中5-羟色胺刺激的肺动脉平滑肌细胞的增殖fig.2 bone marrow mesenchymal stem cells transfected with ho-1 plasmid inhibited the proliferation of pulmonary artery smooth muscle cells in response to serotoin in co-culture system (n=3 in each group)与对照组相比，*p<0.01;与5-羟色胺刺激的单纯肺动脉平滑肌细胞或野生型干细胞共培养体系中的肺动脉平滑肌细胞相比，#p<0.05。
2.3表达ho-1的干细胞抑制共培养体系中肺动脉平滑肌细胞rhoa的激活rhoa信号传导通路在肺动脉平滑肌细胞收缩及增殖中起着重要的作用，为探讨骨髓间质干细胞携带的ho-1基因抑制共培养体系中肺动脉平滑肌细胞增殖的分子机制，检测了5-羟色胺诱发的rhoa的激活。我们既往的研究已证实，5-羟色胺诱发平滑肌细胞中rhoa激活的峰值时间是10min[3]。故此，我们检测了5-羟色胺刺激细胞10min后rhoa的活性。结果发现，在单纯平滑肌细胞培养或野生型干细胞共培养体系中，5-羟色胺可使平滑肌细胞rhoa活性增加2.90或2.78倍(p<0.01，与对照组相比)，而在表达ho-1干细胞共培养体系中肺动脉平滑肌细胞的rhoa活性仅增加了1.47倍(p<0.05，与野生型干细胞共培养体系相比)。提示干细胞所携带的ho-1基因通过抑制rhoa的激活而抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖(图3)。
3讨论
肺血管重塑在各种类型肺动脉高压的发生中起着关键性的作用。肺动脉平滑肌细胞迁移、增殖导致肺血管壁增厚为肺血管重塑的主要病理基础。血管重塑引起的血管腔狭窄导致肺血管阻力升高，最终诱发肺动脉高压[3]。持续性的肺动脉高压可导致右心衰竭，甚至引起患者死亡，因而寻求有效的治疗方式和治疗靶点，有效抑制平滑肌细胞的增殖是肺动脉高压治疗的关键。图3携带ho-1基因的骨髓间质干细胞抑制共培养体系中5-羟色胺诱发的肺动脉平滑肌细胞中rhoa的激活fig.3 bone marrow mesenchymal stem cells transfected with ho-1 plasmid inhibited the activation of rhoa of pulmonary artery smooth muscle cells in response to serotoin in co-culture system (n=3 in each group)与对照组相比，*p<0.01;与5-羟色胺刺激的单纯肺动脉平滑肌细胞或野生型干细胞共培养体系中的肺动脉平滑肌细胞相比，#p<0.01。
骨髓间质干细胞是一种多能干细胞，可分化为血管内皮祖细胞及多种组织终末细胞，包括血管内皮细胞及平滑肌细胞。动物及临床研究证实，外周血中循环的血管内皮祖细胞数量减少或功能异常与肺动脉高压的发生有着一定的相关性[4-5]。缺乏或异常的血管内皮祖细胞可减弱机体对损伤血管内皮细胞的修复，导致肺血管的持续性收缩，参与肺动脉高压发生。移植血管内皮祖细胞或骨髓间质干细胞可促进内皮细胞的损伤修复，进而预防或治疗肺动脉高压的发生[5-6,9]。基因治疗肺动脉高压是最近几年刚起步的一个研究领域，骨髓间质干细胞以其独特的性能常被用作基因载体细胞。有学者探讨过以内皮型一氧化氮合酶(enos)、降钙素基因相关肽(cgrp)及前列环素合成酶修饰的内皮祖细胞或骨髓间质干细胞治疗肺动脉高压的体内及体外研究，取得了令人鼓舞的结果[10-12]。ho-1为诱导型的热休克蛋白32，可降解血红素产一氧化碳(co)、铁及胆红素。co具有广泛的抗炎、抑制细胞增殖作用[13]。动物实验证实，增加ho-1的功能可预防或治疗动物模型中肺动脉高压的发生[7]。我们设想预先以ho-1 基因修饰骨髓间质干细胞再移植入动物或患者体内，ho-1产生的co可以旁分泌的形式作用于肺血管平滑肌细胞抑制其增殖，减轻肺血管重塑，必将更有效地抑制肺动脉高压的发生。为探讨该种治疗方式的可行性，我们于体外将携带ho-1基因的髓间质干细胞与肺动脉平滑肌细胞共培养，观察携带ho-1基因的干细胞能否抑制平滑肌细胞的增殖，为肺动脉高压的基因治疗提供依据。
我们的研究结果提示，5-羟色胺可明显刺激肺动脉平滑肌细胞的增殖。野生型干细胞与肺动脉平滑肌细胞共培养并不能抑制5-羟色胺刺激的平滑肌细胞增殖，但携带ho-1基因的骨髓间质干细胞则可明显抑制肺动脉平滑肌细胞增殖，提示干细胞携带的ho-1基因表达产物可以旁分泌的形式有效抑制平滑肌细胞的增殖。若将该种干细胞移植入动物或人体内，分化为血管内皮细胞后不但可修复损伤的血管内皮，亦可抑制平滑肌细胞的增殖，减轻肺血管重塑，从多个方面预防及治疗肺动脉高压。
我们进一步探讨了骨髓间质干细胞所携带的ho-1基因抑制肺动脉平滑肌细胞增殖的分子基础。rhoa信号传导通路在肺动脉高压的发生中起着重要的作用。该通路的激活可诱发平滑肌细胞的收缩，促进平滑肌细胞的增殖，引起细胞外基质的重塑，从而导致肺动脉高压的发生[3]。动物实验证实，抑制rhoa信号传导系统可预防或治疗缺氧或monocrotalin诱发的模型动物中肺动脉高压的发生[14]。在本研究中我们发现，5-羟色胺可引起肺动脉平滑肌细胞中rhoa活性增加2.90倍，野生型干细胞与肺动脉平滑肌细胞共培养并未能改变5-羟色胺刺激的rhoa激活，但在携带ho-1基因的干细胞共培养体系中，5-羟色胺诱发的rhoa活性明显降低，提示干细胞所携带的ho-1可以旁分泌的形式抑制rhoa的激活进而抑制细胞的增殖。ho-1作用的机制可能与其产生的co通过激活cgmp信号通路进而抑制rhoa激活有关[3,15]。
在此研究的基础上，我们将进一步以携带ho-1基因的干细移植入肺动脉高压的动物模型体内，观察抑制肺动脉高压发生的可行性及效果，为肺动脉高压的干细胞/基因治疗提供实验依据。
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