作者：陈丽霞,张玉珍,徐发彬,林青梅,谈海东,廖慧慧,黄晓利,梁晓云,赵燕
【摘要】 【目的】观察补肾健脾法中药复方对卵巢早衰（pof）小鼠抑制素b（inhb）含量及基因表达的影响。【方法】选用雌性balb/c小鼠随机分为正常对照组、模型组、中药预防组和中药治疗组。除正常对照组外，其他3组采用sd大鼠卵巢抗原与弗氏佐剂注射免疫法复制自身免疫性卵巢功能衰退小鼠模型。中药预防组于第1次免疫后开始灌服中药复方汤剂，连续17 d，中药治疗组于第3次免疫后开始灌服中药复方汤剂，连续5 d，剂量均为20 g·kg-1·d-1。采用酶联免疫吸附法检测各组血清inhb含量，逆转录—聚合酶链反应（rtpcr）法检测各组卵巢组织inhb mrna表达水平，并观察各组小鼠卵巢病理改变。【结果】模型组小鼠血清inhb含量、卵巢组织inhb mrna相对表达量均显著降低（p<0.05或p<0.01），光镜下未见明显生长或成熟卵泡；中药预防组血清inhb含量、卵巢组织inhb mrna相对表达量均显著升高（p<0.05或p<0.01），卵泡数目略减少，无明显病理改变；中药治疗组卵巢组织inhb mrna相对表达量显著升高（p<0.05），而对血清inhb含量无影响（p>0.05），生长成熟卵泡减少，且卵巢组织出现病理改变。WWW.11665.CoM各组小鼠血清inhb含量与卵巢组织inhb mrna表达变化呈相似趋势，且中药预防组作用优于中药治疗组。【结论】补肾健脾法中药复方治疗卵巢早衰的作用与其能增强卵巢组织inhb mrna表达，升高inhb含量，改善卵巢的储备功能有关。
【关键词】 卵巢早衰/中药疗法；补肾健脾法；基因表达调控；卵巢/病理学；疾病模型，动物；大鼠；小鼠
abstract：objectiveto probe the mechanism of the chinese compound recipe, which has the actions of tonifying the kidney and strengthening the spleen, on inhibin b (inhb) content and its gene expression level in mice with immune premature ovarian failure (pof). methodsfemale balb/c mice were divided into 4 groups randomly: normal control group, model group, treatment group and prevention group. the autoimmune pof were induced in balb/c mice except for the normal control group. treatment group were treated with chinese compound recipe (20 g·kg-1·d-1) for 5 continuous days after the third immunization, and prevention group were given chinese compound recipe for 17 continuous days after the first immunization. the mice serum inhb content was (continued on page 591)
卵巢早衰(premature ovarian failure,pof)是引起卵巢功能衰退常见的疾病，其发病率在妇女中占1%~3%,占继发性闭经的2%~10%［1］,是当今生殖医学和生殖健康研究的热点和难点。研究认为卵巢储备功能低下的妇女,卵泡颗粒细胞抑制素的产生减少,不能将卵泡刺激素(fsh)抑制在正常范围内,提示卵泡衰老［2］。维持卵泡完整性所需蛋白质mrnas的变化,预示凋亡过程的开始［3］，而闭锁过程是促进或抑制凋亡的关键基因产物有序表达的结果［4］。临床研究表明［5］补肾健脾中药对卵巢功能早衰患者具有较好疗效。本研究观察了补肾健脾中药对pof小鼠抑制素b（inhb）及其基因表达的影响，现报道如下。
1材料与方法
1.1动物健康balb/c小鼠,雌性,spf级,8～10周龄,体质量18～22 g；sd大鼠,雌性,spf级,体质量约250 g，均由广州中医药大学实验动物中心提供,大小鼠合格证号：0016889和0016888。
1.2主要试剂及仪器弗氏完全佐剂(cfa)和弗氏不完全佐剂(ifa)均为美国sigma公司产品，小鼠inhb试剂盒为美国rapid bio lab公司产品, model 550 microplate reader为美国biorad公司产品,逆转录—聚合酶链式反应(rtpcr)试剂、逆转录酶均为北京索奥公司产品,gds7600凝胶扫描系统(df23b)为英国uvp公司产品,pe9700pcr扩增仪为美国pe公司产品。
1.3药物补肾健脾法中药复方由菟丝子、党参、枸杞子、淮山、仙灵脾、女贞子、杜仲等组成,并制成浓缩液,含生药1 g/l。
1.4卵巢抗原的制备收集sd雌性大鼠的卵巢组织,称质量,洗净,于trishcl缓冲液(ph 7.6、0.05 mmol/l，150 mmol/l nacl，4 mmol/l乙二胺四乙酸，2 mmol/l柠檬酸，0.1 mmol/l苯甲基磺酰氟)中剪碎并研磨成匀浆,低温下超声粉碎5 min,低温离心(4 000 r/min×15 min,10 000 r/min×5 min)取上清,调整浓度为200 mg/ml,置于-20℃保存。
1.5自身免疫性卵巢功能衰退小鼠动物模型复制 ［6］免疫前通过阴道脱落细胞涂片筛选正常性周期小鼠，每只小鼠两后脚掌和腹部多点皮下注射：10 mg(0.05 ml)卵巢抗原加cfa混合乳化液0.1 ml。首次免疫间隔1周,以卵巢抗原与ifa等量乳化加强免疫1次，5 d后再加强免疫1次。第3次免疫后5 d处死小鼠,摘眼球留取血清,收集卵巢组织,待检测。
1.6分组及给药将雌性balb/c小鼠随机分为4组,每组5只。正常对照组以磷酸盐缓冲液（pbs）代替卵巢抗原免疫,不灌服药物；模型组不灌服药物；中药预防组于第1次免疫后即开始灌服中药复方汤剂以预防pof的发生,剂量为20 g·kg-1·d-1,连续17 d；中药治疗组于第3次免疫后开始灌服中药复方汤剂,剂量为20 g·kg-1·d-1,连续5 d。
1.7取材及指标检测取血清采用双抗体夹心酶联免疫吸附(sandwichelisa)法检测inhb水平；取卵巢组织采用rtpcr法检测inhb mrna的表达,gapdh为内参照进行rtpcr扩增。指标检测均参考说明书进行。另取卵巢组织固定包埋切片染色后在光镜下行组织病理学检查。
1.8统计学方法采用spss 11.5统计学软件进行数据分析。
2结果
2.1各组小鼠的一般情况造模后各组均出现不同程度的活动、摄食增加,略显活跃,烦躁,攀爬噬咬鼠笼,毛松缺乏光泽较干枯,大便增多。
2.2各组小鼠造模前后阴道涂片观察比较正常对照组小鼠阴道细胞涂片结果：动情周期规律,可见大量角化细胞及羊齿状结晶,细胞着色较深。免疫造模后小鼠阴道细胞涂片结果：模型组动情期紊乱,细胞无周期性改变,上皮细胞体积明显缩小,较幼稚,角化细胞和羊齿状结晶明显减少,渐消失，并逐渐被白细胞所代替。中药治疗组动情期不典型,角化细胞和羊齿状结晶亦减少。中药预防组动情间期延长,角化细胞和羊齿状结晶略减少,细胞着色较正常组稍淡。
2.3各组小鼠卵巢病理改变肉眼观察见模型组卵巢体积较正常组卵巢缩小,双角子宫变细长,部分卵巢与周围粘连。光镜检查显示：与正常对照组比较,中药预防组卵泡数目略减少,余无明显改变。中药治疗组除生长成熟卵泡减少外,部分卵母细胞及透明带形态异常,厚薄不均,扭曲,部分断裂,周边颗粒细胞排列紊乱,细胞形态不规则；闭锁卵泡增多,且细胞结构紊乱。模型组未见明显生长或成熟卵泡(图1，见彩图页第665页)。
2.4各组小鼠血清inhb含量比较表1结果显示：模型组小鼠血清inhb含量显著降低(p<0.05)，中药预防组血清inhb含量显著升高，与模型组及中药治疗组比较差异均有显著性意义(p<0.05)，中药治疗组对血清inhb含量无影响(p>0.05)。表1各组小鼠血清inhb含量比较(略)
统计方法：单因素方差分析；①p<0.05,与正常对照组比较；②p<0.05,与模型组比较；③ p<0.05,与中药治疗组比较
2.5各组inhb mrna相对表达量比较表2、图2结果显示：小鼠卵巢组织inhb mrna相对表达量模型组显著降低(p<0.01)，中药预防组与中药治疗组均显著升高(p<0.05或p<0.01)，且中药预防组作用优于中药治疗组(p<0.01)。表2各组inhb mrna相对表达量比较(略)
统计方法：单因素方差分析；①p<0.01,与正常对照组比较；② p<0.05,③p<0.01,与模型组比较；④ p<0.01,与中药治疗组比较a.
3讨论
3.1自身免疫性卵巢功能衰退模型的建立临床上发现部分卵巢早衰患者有自身免疫反应过强的现象,亦有病理检测发现部分患者的卵巢有淋巴细胞浸润,诊断为自身免疫性卵巢炎［7］。通过免疫方法造模是目前国内外卵巢早衰模型较为常用且相对成熟的一种方法［7］。
建立自身免疫性疾病模型通常有3种方法［8］：①将正常t细胞转移至无胸腺的裸鼠体内；②切除新生3 d动物的胸腺；③应用来自自身组织的特异性肽链进行主动免疫。有文献报道［9］切除新生小鼠或大鼠胸腺可造成多腺体自身免疫性疾病,如自身免疫性甲状腺炎、溃疡性结肠炎等,往往多种疾病同时并存。balb/c小鼠为个体遗传性状近乎一致的纯系小鼠,以sd大鼠卵巢作为特异性抗原免疫小鼠产生单纯免疫性卵巢炎,即相当于应用来自该组织的特异性肽链进行主动免疫产生的自身免疫性疾病,避免了多腺体疾病的交叉影响,研究可更直接,更纯一［7］。因此,本研究设计采用这种方式复制动物模型。3次免疫后,小鼠动情周期的改变、卵巢功能的减退、组织病理的损伤等均证实自身免疫性卵巢功能衰退动物模型的复制成功。
3.2pof检测血清inhb含量的意义抑制素(inhibin,inh)属于转化生长因子β(tgfβ)超家族成员,是抑制fsh分泌的重要抑制因子［10］。抑制素降低引起fsh升高的变化反映了处于卵巢年龄的卵泡反应性和能力的降低［2］。精确监测表明［11］,inhb是卵泡期颗粒细胞分泌的主要形式。研究认为［2］卵巢储备功能低下的妇女,卵泡颗粒细胞inhb的产生减少,不能将fsh抑制在正常范围内,提示卵泡衰老。 45~49岁围绝经期妇女卵泡期inhb水平较低,fsh水平较高,进一步证实inhb和fsh之间的相互关系。故将早期inhb的下降考虑为卵巢储备功能下降的关键环节，而测定血清inhb可作为预测pof最灵敏的指标［2］。由卵巢颗粒细胞分泌的inhb水平直接反映卵巢的储备功能 ［12］。一般认为卵泡早期测定时血清fsh水平超过20 u/l,或超过10 u/l并伴有抑制素水平下降,提示卵巢储备功能已经降低,患者可能已经步入卵巢功能衰退进程中［13］。
3.3各组小鼠给药后血清inhb含量变化与inhb mrna表达差异的关系中医学中无卵巢早衰的病名,但与此病类似的记载散见于“月经后期”、“月经过少”、“年未老经水断”、“闭经”、“血枯”、“血隔”、“不孕症”等病症中。肾藏精且主生殖,肾气的盛衰,直接关系到肾—天癸—冲任—胞宫轴的功能状态,成为主宰孕育的根本。脾胃为后天之本,气血生化之源。《女科经纶》说：“妇人经水与乳,俱由脾胃所生。”因此,脾肾亏虚是该病的重要病机。方中菟丝子辛、甘、平,归肾、肝、脾经,功能补肾益精养肝,平补肾阴阳,是调经、种子、安胎首选药；人参味甘微温,归脾、心经,功能大补元气补脾益肺,安神益智。菟丝子、人参共为君药。枸杞子补血养阴,填精益髓,滋养肝肾,与淫羊藿温肾壮阳,共助君为臣。君臣合用既能大补气血精,又能调补肾阴阳。柴胡、丹参疏肝活血为佐,炙甘草补脾益气、调和诸药为使。诸药共奏补肾健脾之效。本研究结果显示：中药预防组可显著升高血清inhb含量及卵巢组织inhb mrna相对表达量，中药治疗组可显著升高卵巢组织inhb相对表达量，对血清inhb含量无明显影响，表明中药预防组作用优于中药治疗组。各组小鼠血清inhb含量与inhb mrna表达的变化有相似的趋势。inhb mrna及inhb的变化规律说明其蛋白的表达增加或减少是由基因的转录水平升高或下降引起的，从而推测这可能是补肾健脾中药治疗卵巢功能早衰的一个重要机理：通过增强卵巢组织inhb mrna的表达,从而提高inhb的含量,改善卵巢的储备功能，可从早期对卵巢储备功能的下降起阻碍或延缓的作用。
【参考文献】
［1］王伟,李继俊.卵巢早衰的病因学研究进展［j］.现代妇产科进展,2002,11(2):136．
［2］hofmann g e, danforth d r, seifer d b.inhibinb: the physiologic basis of the clomiphene citrate challenge test for ovarian reserve screening［j］.fertil steril,1998,69(3):474．
［3］tilly j l, kowalski k i, schomberg d w. apoptosis in atretic ovarian follicles is associated with selected decreases in messenger ribonucleic acid transcripts for gonadotropin receptors and cytochrome p450 aromatase［j］. endocrinology,1992,131：1670．
［4］dees w l, hiney j k, schultea t d.the primate ovary contains a population of catecholaminergic neuronlike cells expressing nerve growth factor receptors［j］. endocrinology,1995,136：5760.
［5］史云,张玉珍.补肾健脾调肝活血法治疗卵巢功能早衰临床观察［j］.中医药学刊,2006,24(6):1174.
［6］朱玲,罗颂平,许丽绵,等.左归丸对小鼠自身免疫性卵巢损伤的保护作用［j］.中国中西医结合杂志,2005,25(10)：920．
［7］蔡立荣, 李大金, 孙晓溪, 等. 补肾活血方对小鼠实验性卵巢早衰防治作用的研究［j］. 中国中西医结合杂志，2001，21(2): 126．
［8］tung k s k.short analytical review∶mechanism of selftolerance and events leading to autoimmune disease and autoantibody response［j］.clin immunol immunopathol,1994,73：275．
［9］kosiewice m m,michael s d.neonatal thymectomy affects follicle population before the onset of autoimmune oophoritis in b6a mice［j］.j reprod fert,1990,88：427．
［10］rivier c, rivier j, vale w. inhibinmediated feedback control of folliclestimulating hormone secretion in the female rat［j］.science,1986,234：205．
［11］ groome n p, lllingworth p g,obrien m, et al. measusrement of dimeric inhibin b throughout the human menstrual cycle［j］.j clin endocrinol metab,1996,81：1401．
［12］hofmann g e,danforth d r,seifer d b fertil steril［j］.l998,69(3):474．
［12］tinkanen h,blauer m,laippaa p,et al. correlation between serum inhibin b and other indicators of the ovarian function［j］. eur j obstet gynecol repro biol,2001,94(l):103．
［13］杨业洲,韩字研.卵巢早衰的防治原则［j］.实用妇产科杂志,2003,4(19):201．
