作者：孙芸 冯高平 毛晓春 陈琳熹
【摘要】 ：目的 通过研究滋阴补肾丸对广防己中马兜铃酸a含量的影响,探讨广防己的解毒问题。方法 广防己与滋阴补肾丸共煎后,采用rp-hplc法测定马兜铃酸a的吸收值,观测其含量的变化情况。结果 加入滋阴补肾丸后,广防己中马兜铃酸a的含量明显降低。结论 滋阴补肾丸可显著降低广防己中马兜铃酸a的含量。
【关键词】 滋阴补肾丸 广防己 马兜铃酸a 减毒作用
abstract：objective to study the effects of ziyin bushen pill on aristolochia acid a in aristolochia fangchi, and preliminary study on reducing poisonous effects of ziyin bushen pill to aristolochia fangchi. methods absorption of aristolochhia acid a in the mingled decoction of aristolochia fangchi and ziyin bushen pill by hplc, and the change of aristolochia acid a was observed. results aristolochia acid a content of aristolochia fangchi was markedly decreased after ziyin bushen pill was added. conclusion ziyin bushen pill can markedly decreased aristolochhia acid a content of aristolochia fangchi.
key words：zinyin bushen pill；aristolochia fangchi；aristolochia acid a；reduce poisonous effect
广防己的药用标准虽然已被取消,但其中所含主要毒性成分马兜铃酸的解毒一直是许多专家致力于解决的问题。Www.11665.cOm为了研究滋阴补肾丸对广防己的减毒作用及机理,我们设计了以下实验。
1 实验材料
1.1 仪器
日立l6000型高效液相色谱系统,包括l-4200h uv-vis detector d-2500型色谱数据处理仪。ma240d电子分析天平,上海第二天平仪厂。gq7oe-5型红外快速干燥箱,上海市吴淞五金厂。数显恒温水浴锅,金坛市大地自动化仪器厂。
1.2 药物
广防己,为马兜铃科植物广防己aristolochi fangchi y.的干燥根,购自中国药品生物制品检定所,批号919-9001。滋阴补肾丸(浓缩丸),甘肃省河西制药有限公司生产,批号060601。
1.3 试剂
马兜铃酸a对照品(aristolochic acid a,以下简称aa-ⅰ),由中国药品生物制品检定所提供,批号110746-200406。甲醇、乙腈为色谱纯,山东省禹王实业总公司禹王化工厂产品；无水乙醇、冰醋酸为分析醇,购于安徽医药公司。水为纯化水。
1.4 色谱条件
色谱柱：依利特hypersil ods25(4.6 mm×250 mm),柱号为e：1417177；流速：1 ml/min；柱温：室温；检测波长：250 nm；进样量：10 μl；流动相：乙腈-(水＋冰醋酸)＝48∶52,其中,水-冰醋酸＝62.5∶1。理论塔板数不低于2 000。
2 方法与结果
2.1 标准溶液的制备
称取aa-ⅰ对照品7 mg,置于50 ml量瓶中,加无水乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得浓度为0.14 mg/ml的对照品储备液。精密量取对照品储备液2.0 ml于10 ml量瓶中,用无水乙醇定容至刻度,摇匀,即得浓度为0.028 mg/ml的aa-ⅰ对照品溶液。
2.2 供试液的制备
2.2.1 广防己样品溶液的制备
精密称取广防己样品0.6 g,置于200 ml烧杯中,加120 ml自来水,煎煮30 min,过滤,收集滤液,残渣加80 ml自来水,煎煮30 min,过滤,收集滤液,合并两次滤液,置于水浴上,浓缩至干。用适量的无水乙醇溶解并完全转移至10 ml的量瓶中,加无水乙醇至刻度,摇匀。放入冰箱冷藏,静置过夜。抽取上清液,过滤,弃去初滤液,收集续滤液,放入1 ml塑料离心管中,作为供试液1。
2.2.2 广防己与滋阴补肾丸供试液的制备
分别取广防己样品、滋阴补肾丸粉末少许,各精密称取0.6 g,置于200 ml烧杯中,混合两种药物,加入120 ml自来水,按“2.2.1”项下制备广防己样品溶液的方法进行操作,其制备液作为供试液2。
2.3 马兜铃酸a对照品的定性分析
分别吸取供试液1和对照品溶液,注入液相色谱仪,按“1.4”项下色谱条件,测绘其色谱图。色谱图见图1。
2.4 标准曲线的制备
精密吸取对照品储备液1、2、3、4、5、6 ml,分别置10 ml的量瓶中,用无水乙醇稀释至刻度。按“1.4”项下的色谱条件,依次进样测定,测得aa-ⅰ的峰面积。以aa-ⅰ的进样量(μg)为横坐标,以对应的峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。由标准曲线可知,在0.08～0.40 μg之间,进样量与峰面积之间呈良好的线性关系,回归方程为：y＝1.7×105x＋5 248,r＝0.999 9。
2.5 精密度试验
精密吸取对照品溶液10 μl,按“1.4”项下的色谱条件,注入液相色谱仪,测定对照品溶液的峰面积,平行测定5次。结果rsd＝0.45%,表明精密度良好。
2.6 稳定性试验
按“1.4”项下色谱条件,精密吸取10 μl供试液1,注入液相色谱仪,测定,然后于2、4、8、12、24 h各测定1次,结果rsd＝0.10%,表明供试品溶液在24 h内测定结果稳定。
2.7 重复性试验
取广防己样品0.6 g,精密称定,共称取5份,照“2.2.1”项下操作,制成供试品溶液。在“1.4”项下的色谱条件下,分别精密吸取供试品溶液各10 μl,注入液相色谱仪,测定,计算aa-ⅰ的质量。结果rsd＝0.78%,表明重复性良好。
2.8 加样回收率试验
取0.2 ml供试液1,用无水乙醇定容为1 ml,作为供试液3。取0.2 ml供试液1,加入标准溶液0.15 ml,用无水乙醇定容为1 ml,作为供试液4。取标准溶液0.15 ml,用无水乙醇定容为1 ml,作为供试液5。取以上各供试液10 μl,按“1.4”项下色谱条件测定,结果回收率为(99.5±0.5)%,rsd＝0.5%。
2.9 马兜铃酸a对照品的定量分析
分别取供试液1、2,按“1.4”项下色谱条件测定并计算各样品中aa-ⅰ的含量。结果表明,广防己与滋阴补肾丸共煎后,aa-ⅰ含量降低了30.04%,可见,滋阴补肾丸可以明显降低广防己中aa-ⅰ的含量。见图2、表1。表1 广防己与滋阴补肾丸共煎后的aa-i含量比较（略）
3 讨论
国内外学者现已公认,广防己的肾毒性与其所含主要成分马兜铃酸有关,而其中马兜铃酸a为主要毒性成分[1],且含量较大,故将马兜铃酸a作为测试指标。在提取方法上为了尽量符合临床实际,我们选用了加热水提的方法,提取次数为2次。
广防己祛风止痛、清热利水,主治湿热身痛、风湿痹痛、下肢水肿、小便不利等症[2]。湿热之邪极易伤阴,同时广防己利水亦易伤阴。故需配伍养阴药,使邪正兼顾。肾阴为一身阴津之根,滋阴补肾丸为中医滋补肾阴的代表方剂,滋补肾阴,增强正气,既能补已伤之阴液,又能防阴液之再耗。其滋阴之作用,恰恰能制约广防己的利水伤阴之性。因而滋阴补肾丸能够降低广防己利水伤阴的不良反应。
本研究表明,滋阴补肾丸可以明显降低广防己中马兜铃酸a的含量,为广防己等含马兜铃酸类中药的解毒提供了科学依据和新的思路。
【参考文献】
[1] vanhaelen m, vanhaelen-fastre r, but p, et al.identification of aristolochin acidi in chinese herbs[j].lancet,1994,343：174.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[s].北京：化学工业出版社,2000.31－32.
