作者：陈鹊汀，刘智勤，朱惠学，王海波，李中
【摘要】 目的观察当归补血汤对环磷酰胺（cyclophosphamide，ctx）化疗荷瘤小鼠免疫功能的影响。方法建立s180荷瘤小鼠模型后，随机分为4组，荷瘤对照组、ctx组、当归补血汤＋ctx组及当归补血汤组。造模次日开始给药，共10 d，停药次日处死，测定脾脏和胸腺指数、腹腔巨噬细胞吞噬功能、nk细胞活性、t淋巴细胞增殖能力。结果当归补血汤可提高化疗荷瘤小鼠脾脏和胸腺指数、腹腔巨噬细胞吞噬功能和nk细胞活性，同时还对刀豆素a（cona）诱导的t淋巴细胞增殖有促进作用。结论当归补血汤具有提高机体免疫功能，抵御化疗所引起的免疫功能下降的作用。
【关键词】 当归补血汤； 肿瘤； 免疫功能； 化疗
当归补血汤方出自李东垣《内外伤辩惑论·暑伤胃气论》，为气血双补之经典名方。研究表明，此方具有增强免疫的效果［1］。但有关当归补血汤对化疗荷瘤小鼠免疫系统的影响报道较少，我们通过建立s180荷瘤小鼠模型，观察了当归补血汤对环磷酰胺（cyclophosphamide ，ctx）化疗荷瘤小鼠免疫功能的影响，旨在为该方的临床应用提供一定实验依据。wWw.11665.com
1 材料与仪器
1.1 动物及细胞株
清洁级昆明小鼠，7～9周龄，雌雄各半，体质量18～22g，由河北医科大学实验动物中心提供，许可证：scxk(冀)2003-1-003。动物在实验前适应性驯养1周。饲料和垫料由河北医科大学实验动物中心提供。实验期间自由采食饮水。腹水型s180瘤株由河北医科大学实验动物中心提供，l929细胞株由北京市中医研究所提供。
1.2 药品
当归补血汤由黄芪和当归组成（饮片由河北大学附属医院中药房提供，所有药品均经中药专家鉴定），将上述药物加水浸泡20min后，煎煮3次，约30min/次，3煎溶液混合过滤，取汁300ml，离心取上清，80℃水浴浓缩至每毫升含生药1.2g，分装，高温消毒后置于4℃冰箱保存备用。化疗药物：注射用环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司(批号：06112021)。
1.3 试剂及仪器
dmso(amresco公司产品)，四氮甲唑蓝(mtt，amresco公司产品)，刀豆蛋白a(cona，sigma公司产品)，rpmi-1640完全培养基(amresco公司产品)。酶标分析仪（北京普朗新技术有限公司产品），co2培养箱（上海福玛实验设备有限公司产品），超净工作台(苏净集团，苏州安泰空气技术有限公司产品)，倒置显微镜（南京江南永新光学有限公司产品）。
2 方法
2.1 动物模型的建立［2］
无菌条件下抽取6～7 d生长良好的s180小鼠的腹水，按1∶3比例用生理盐水稀释，反复冲打，充分混匀，在显微镜下计数，用生理盐水调整细胞浓度为1.5×107/ml，取0.2ml于每只小鼠右侧腋窝下碘酊消毒后皮下接种。瘤株接种前，均用0.2%台盼蓝染色，计算活细胞数为95%～98%。从抽取腹水时开始，到移植完最后1只小鼠的总时间控制在1 h内。
2.2 分组及给药
小鼠接种24 h后按体质量和性别随机分成荷瘤对照组、ctx组、当归补血汤+ctx组和当归补血汤组。荷瘤对照组均用生理盐水灌胃，同时腹腔注射生理盐水，单纯化疗组腹腔注射ctx 0.02 g·kg-1·d-1，同时用生理盐水灌胃，当归补血汤+ctx组腹腔注射ctx 0.02 g·kg-1·d-1，同时用当归补血汤12g·kg-1·d-1（按生药量计算，剂量由预实验得出）灌胃，当归补血汤组用当归补血汤12 g·kg-1·d-1灌胃，同时腹腔注射生理盐水，各组灌胃容积均为0.4 ml/只，腹腔注射容积均为0.2 ml/只，各组于瘤细胞接种第2日开始用药，1次/d，连续10 d。
2.3 脾脏、胸腺指数
小鼠脱臼处死，以无菌操作取下脾脏、胸腺，电子天平称质量并计算脏器指数。
2.4 腹腔巨噬细胞吞噬功能的测定［3］
小鼠脱臼处死，75%酒精中浸泡2 min，置超净台。每只小鼠腹腔注射冷pbs液10 ml，轻揉腹部2 min，回抽腹腔液，离心弃上清。rpm1－1640培养液洗两次，计数并调节细胞浓度为2×106个/ml，加入96孔培养板，每孔100 μl，每样本均设3个复孔。37℃，5%co2培养箱培养4 h，温pbs液洗并吸出未贴壁细胞，得到巨噬细胞单层。于每孔中加入0.03%的中性红溶液100μl，置co2培养箱培养1 h，用温pbs液反复冲洗未被吞噬的中性红3次。于每孔中加入细胞裂解液（1∶1的冰醋酸和无水乙醇)100 μl，4℃静置过夜，用酶标仪在570nm处测定od值。
2.5 nk细胞活性测定［4］
无菌摘取脾脏，按常规制备脾细胞悬液，用含10%小牛血清的rpmi－1640培养液配成1×107/ml浓度作为效应细胞。取传代培养的l929细胞，用0.25%胰酶消化液消化2min，加入完全rpmi－1640培养液，调细胞浓度为2×105/ml作为靶细胞，在96孔平底板上每孔加入靶细胞悬液100 μl，37℃，5%co2培养90 min，使其贴壁成单层细胞，然后实验孔加入100 μl效应细胞悬液，做4个复孔，靶细胞对照孔加完全rpmi－1640培养液100μl；然后将96孔板放在37℃，5%co2孵箱中孵育20 h，去上清，用生理盐水轻轻注满各孔，反复3次，以除去效应细胞和被杀伤脱落的靶细胞，在滤纸上吸干孔内水分；每孔加入0.1%的中性红染液100μl，孵育30min，弃去染液，用生理盐水洗3遍，每孔加100μl细胞裂解液，使含有中性红的靶细胞溶解，摇匀，用酶标仪在450 nm测od值，用以下公式计算杀伤率。
杀伤率(%)=(靶细胞od值-实验组od值)/靶细胞od值×100%
2.6 t淋巴细胞增殖能力的测定［5］
无菌摘取脾脏，常规制作脾细胞悬液，用含10%小牛血清的rpmi-1640培养基重悬细胞，调细胞浓度至5×106／l，加入96孔细胞培养板100μl/孔，再分别加入cona 100μl/孔使其终浓度为6μg/ml，将上述加好的培养板置37℃、5%co2培养箱68 h，取出，每孔吸出10 μl，加0.5 g/l mtt 10 μl/孔，置培养箱内4 h，取出，加10%sds-hcl溶液100 μl/孔，振荡过夜，酶标仪测570 nm波长的吸光度(od)值。以各样本a值代表其t淋巴细胞增殖能力。
2.7 统计学处理
各组数据以±s表示，用spss 14.0进行方差分析。
3 结果
3.1 当归补血汤对化疗小鼠免疫器官重量的影响
荷瘤小鼠在注射ctx后脾脏和胸腺指数均下降，与荷瘤对照组相比差异显著（p﹤0.01），而在联合应用当归补血汤治疗后，二者均增高，差异显著（p﹤0.05或p﹤0.01）。结果见表1。表1 当归补血汤对化疗荷瘤小鼠免疫器官重量的影响（略）
3.2 当归补血汤对化疗荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
由表2可知，ctx组与各组相比，小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能降低(p<0.01)；ctx联合当归补血汤治疗后，小鼠巨噬细胞吞噬功能升高，差异显著(p<0.05)。表2 当归补血汤对化疗荷瘤小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响（略）
3.3 当归补血汤对化疗荷瘤小鼠nk细胞杀伤率和脾淋巴细胞增殖的影响
荷瘤小鼠用ctx化疗后，nk细胞杀伤率和t淋巴细胞增殖显著降低，统计学差异显著（p﹤0.05或p﹤0.01）；而联合当归补血汤治疗后二者明显升高，差异显著(p<0.01)。见表2。
4 讨论
目前除手术外，化学疗法是治疗肿瘤的重要手段，然而化疗在杀灭肿瘤细胞的同时也抑制了机体的免疫功能［6］，脾脏和胸腺是机体重要的免疫器官。胸腺为初级(中枢)淋巴器官，游走的造血干细胞进入胸腺，在此分化增殖成t淋巴细胞，与细胞免疫有关。脾脏为次级淋巴器官，免疫活性细胞移行于此，并在此进一步增殖、分化和成熟，脾脏中有t淋巴细胞、b淋巴细胞和巨噬细胞，与体液免疫、细胞免疫均有密切关系。二者对细胞毒剂高度敏感，在化疗药物作用下明显萎缩，其组织结构较快地发生严重损伤，从而抑制了机体的免疫和抗病能力。胸腺、脾脏指数在一定程度地反映了机体免疫功能的强弱，因而可用作药物对免疫功能影响的初步观察指标。本实验发现，ctx化疗小鼠的胸腺、脾脏指数明显低于荷瘤组，而荷瘤小鼠用ctx联合当归补血汤治疗后，两脏器指数明显升高，说明当归补血汤可对抗ctx引起的免疫器官受损，保护机体免疫功能。
t淋巴细胞是体内重要的免疫活性细胞，主要发挥细胞免疫功能，在抗肿瘤、免疫监视等方面发挥重要作用。t淋巴细胞在特异性抗原或非特异性抗原，如cona等的诱导下，会发生转化增殖。因此，常将t淋巴细胞的增殖反应作为评价t细胞功能，反映机体免疫状况的常用指标［7］。nk细胞是抗肿瘤的重要效应细胞，它不仅可以直接杀伤肿瘤细胞，也可以通过产生il-2、干扰素等增强其他细胞的抗肿瘤作用［8］。本实验发现，荷瘤小鼠用ctx治疗后，t淋巴细胞增殖能力、nk细胞杀伤率和腹腔巨噬细胞吞噬功能均显著降低，说明ctx可抑制荷瘤小鼠的免疫功能，而用当归补血汤联合ctx治疗后，荷瘤小鼠以上免疫学指标的数值均有所增加，与ctx组比较差异显著，提示当归补血汤可增强化疗荷瘤小鼠的免疫功能，恢复化疗所引起的免疫功能低下，这为该方在临床的应用提供了一定实验依据。
【参考文献】
1］苗明三，方晓艳.当归补血汤粗多糖对免疫抑制小鼠免疫功能的影响［j］.中药药理与临床，2003，19(6)：8.
［2］刘智勤，朱惠学，陈鹊汀，等.六君子汤对环磷酰胺的增效减毒作用研究［j］.时珍国医国药，2008，19（9）：2150.
［3］贺宇彤，刘殿武，丁里玉.抗纤ⅰ号和硒对肝纤维化大鼠免疫功能的调节作用［j］.中国中医基础医学杂志，2004，10(3):40.
［4］付于，夏天．消瘤汤治疗肿瘤及调节免疫功能的实验研究［j］.中国中西医结合杂志，2004，2（12）：1114.
［5］陈奇.中药药理研究方法学，第2版［m］．北京：人民卫生出版社，2006：748.
［6］sakamoto j，teramukai s，nakazato h，et al.efficacy of adjuvant immunochemotherapy with ok-432 for patients with curatively resected gastric cancer:a meta-analysis of centrally randomized controlled clinical trials［j］.j immunother，2002，25(5)：405.
［7］zhou g，sheng w，yao w，et al.effect of low molecular lambda-carrageenan from chondrus ocellatus on antitumor h-22 activity of 5-fu［j］.pharmacol res 2006，53(2)：129.
［8］yang l，parkin dm，li ld，et al. bray f estimation and projection of the national profile of cancer mortality in china［j］.br j cancer，2004，90(11)：2157.
