作者：郑亚玉，梁光义，钟正灵，张丽艳，靳凤云，曹佩雪，杨玉琴，陈添福
【摘要】 目的对当归六黄汤分煎样品与合煎样品中阿魏酸、盐酸小檗碱、黄芩苷的含量进行比较，从而为其临床应用提供依据。方法均采用反相液相色谱法，dikma odsc18柱(5 μm 4.6 mm×250 mm)，以0.085％磷酸－乙腈为流动相梯度洗脱，流速为1.0 ml·min-1，柱温：35℃，检测波长为326nm测定阿魏酸。以乙腈－0.5%的三乙胺（磷酸调ph=3.00)（27∶73）为流动相，流速为1.0 ml·min-1，柱温：30℃，检测波长为343 nm测定盐酸小檗碱。以甲醇水－磷酸(55∶45∶0.2)为流动相，检测波长为280 nm，流速为1.0ml·min-1，柱温30℃测定黄芩苷。结果3个指标性成分在分煎样品中平均含量均大于合煎样品中平均含量。结论从中药复方汤剂中指标性成分的含量考虑，当归六黄汤配方颗粒应用于临床具有一定的可行性。
【关键词】 当归六黄汤； 阿魏酸； 盐酸小檗碱； 黄芩苷
china abstract：objectiveto compare the contents of ferulic acid、berberine 、baicalin in single medicine decoction and mixed medicine decoction of danguiliuhuang decoction， and to provide a scientific basis of danguiliuhuangdecoction for clinic. methodsthe samples were determined by hplc. dikma odsc18 column (5 μm, 4.6 mm×250 mm)was used， the mobile phase consisted of 0.085% phosphoricacetonitrile with flow rate 1.0ml·min-1 ， the detection wavelength was set at 326 nm and the column temparature was 35℃ and ferulic acid was detected. the mobile phase consisted of acetonitrile and water（27:73)，which was adjusted to ph3.0 by 0.5％ triethylamine solution and phosphofic acid with flow rate 1.0 ml·min-1 ， the detection wavelength was seted at 343nm ，the column temparature was 30℃and berberine was detected . the mobile phase consisted of methanolwaterphosphoric （55：45：0.2）with flow rate 1.0 ml·min-1. the detection wavelength was set at 280 nm，the column temprature was 30℃ and baicalin was detected.resultsthe contents of ferulic acid 、berberine 、baicalin in single medicine decoction was higher than in mixed medicine decoction.conclusionit can be used in clinic as a reference.
key words： dangguiliuhuang decoction；ferulic acid；berberine；baicalin
当归六黄汤出自李东垣《兰室秘藏》，由当归6 g，生地黄6 g，熟地黄6 g，黄连6 g，黄芩6 g，黄柏6 g，黄芪12 g 7味药组成，药材均为粗末。Www.11665.cOm每服五钱（15g），水两盏（300 ml），煎至一盏（150 ml），口服［1］，主治阴虚火旺证。配方颗粒汤剂与传统汤剂的化学成分、药效是否有明显的差异，配方颗粒是否应广泛应用于临床，还存在争论。本文以阿魏酸、盐酸小檗碱、黄芩苷的含量为指标，采用hplc法比较该方中药配方颗粒（分煎）与传统汤剂（合煎）制得的汤剂中指标性成分的含量是否有差异，从有效成分含量对比方面，为中药配方颗粒应用于临床提供一定理论依据。
1 仪器与试药
aglient 1100高效液相色谱仪(包括真空脱气机，自动进样器，四元泵，dad检测器)，hp1100/ wind3d化学工作站。当归为伞形科植物当归angelica sinensia(oliv.)diels的干燥根，黄芩为唇形科植物黄芩scutellaria baicalensis georgi的干燥根，黄连为毛茛科植物黄连coptis chinensis franch.的干燥根茎，黄柏为芸香科植物黄皮树的干燥树皮phellodendron chinense schneid.黄芪为豆科植物蒙古黄芪astragalus membranaceus (fisch.) bge.var. mongholicus (bge.)hsiao的干燥根，地黄为玄参科植物地黄rehmannia glutinosa libosch.的新鲜或干燥块茎。以上药材均经贵阳中医学院董丽莎教授鉴定。阿魏酸对照品（批号：110773200611）、盐酸小檗碱对照品（批号：110713-200208）、黄芩苷对照品（批号：110715200212）均供含量测定用，购自中国药品生物制品检定所。甲醇、乙腈为色谱纯；水为纯净水；其它试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 分煎、合煎、阴性样品的制备
2.1.1 分煎样品称取黄芪120 g，先加8倍量的水，煎煮1h后过滤，滤渣加6倍量的水煎煮1 h，过滤，合并滤液，浓缩，减压干燥，粉碎。分别称取生地、熟地、黄连、黄柏、当归、黄芩各60 g，按上述方法进行制备，即得各味药材的浸膏粉（该提取工艺为商品化当归六黄汤中药配方颗粒生产工艺，由贵州宏宇药业提供）。
2.1.2 合煎样品按处方比例称取各味药材粗粉，加20倍量的水， 煎煮至10倍量，过滤，浓缩，减压干燥，粉碎，即得传统汤剂样品（传统方法）。
2.1.3 阴性样品按处方比例称取除当归、黄连、黄柏、黄芩外的各味药材浸膏粉，混合均匀，即得分煎阴性样品；按处方比例称取除当归、黄连、黄柏、黄芩外的各味药材，加20倍量的水，煎煮至10倍量，浓缩，减压干燥，即得合煎阴性样品。
2.2 色谱条件
2.2.1 阿魏酸色谱柱为dikma odsc18(5 μm，250 mm×4.6mm)；流动相为0.085％磷酸－乙腈梯度洗脱，0～31 min乙腈14.5％，31～40 min乙腈60％，40～48 min乙腈14.5％； 流速为1.0 ml/min；检测波长为326 nm，柱温35℃。
2.2.2 盐酸小檗碱色谱柱为dikma odsc18(5 μm，250 mm×4.6mm)，流动相为乙腈－0.5%三乙胺，（磷酸调ph=3.00)（27∶73），流速1.0 ml/min，检测波长：343 nm，柱温：30℃。
2.2.3 黄芩苷色谱柱:dikma odsc18(5 μm， 250 mm×4.6 mm)；流动相为甲醇水－磷酸(55∶45∶0.2)；流速为1.0 ml/min；检测波长为280 nm；柱温30℃。
2.3 对照品溶液的制备分别精密称取阿魏酸、盐酸小檗碱、黄芩苷对照品适量，分别制成浓度为12.48 μg/l阿魏酸对照品溶液、156.2 μg/ml盐酸小檗碱对照品溶液、104.4 μg/ml黄芩苷对照品溶液。
2.4 供试品溶液制备
2.4.1 阿魏酸供试品溶液分别精密称取干燥的当归六黄汤分煎与合煎浸膏粉约1.0 g，置250 ml圆底烧瓶中，加70%甲醇100 ml，称重，加热回流30 min，放冷，补足减失重量，过滤，取续滤液过0.45 μm微孔滤膜即得供试品溶液，备用。
2.4.2 盐酸小檗碱供试品溶液分别精密称取干燥的分煎与合煎样品约0.4 g，置具塞锥形瓶中，加盐酸∶甲醇(1∶100) 100 ml，称重，超声处理30 min，放冷，补足减失重量，过滤，取续滤液过0.45 μm微孔滤膜即得供试品溶液，备用。
2.4.3 黄芩苷供试品溶液分别精密称取分煎与合煎浸膏粉约0.4g，置具塞锥形瓶中，加70％乙醇100 ml，称重，超声处理45 min，放冷，补足减失重量，过滤，取续滤液过0.45 μm微孔滤膜即得供试品溶液，备用。
2.5 线性关系考察分别精密吸取阿魏酸、盐酸小檗碱、黄芩苷对照品溶液适量各6份，分别置于10 ml量瓶中，分别加入70％甲醇、盐酸∶甲醇(1∶100)、70％乙醇定容制成不同浓度的阿魏酸、盐酸小檗碱、黄芩苷对照品溶液。精密吸取10 μl注入色谱柱，测定峰面积，以峰面积（a）对进样量（x），绘制标准曲线，计算得阿魏酸回归方程为a=5 613.1x+0.818 6，r=0.999 7 ，在0.012 48～0.124 8 μg范围内线性关系良好；盐酸小檗碱回归方程为a=1 781.4x-3.471 8，r=0.999 97在0.156 2～1.562 0 μg范围内线性关系良好；黄芩苷回归方程为a=2 419.7x-1.563，r=0.999 95，在0.104 4～1.044 μg范围内线性关系良好。
2.6 精密度实验分别精密吸取同一阿魏酸、盐酸小檗碱、黄芩苷对照品溶液10 μl，连续进样6次，在上述色谱条件下测定峰面积，结果rsd分别为0.31％，0.19％，0.09%，表明精密度良好。
2.7 重复性实验精密称取同一批分煎浸、合煎样品各6份，按上述供试品溶液的制备方法和色谱条件，分别测定3种成分的含量，阿魏酸分煎样品rsd为0.01%、合煎样品rsd为0.88%，盐酸小檗碱分煎样品rsd为0.12 %、合煎样品rsd为0.19 %，黄芩苷分煎样品rsd为0.07%、合煎样品rsd为0.56%。结果表明方法具有良好的重复性。
2.8 稳定性实验 按供试品溶液的制备方法处理得3种供试品溶液，照上述色谱条件，阿魏酸供试品溶液分别在0，1.5，3，4.5，6 h测定，阿魏酸分煎、合煎样品rsd分别为2.40％，2.22％，表明阿魏酸供试品溶液在6h内稳定。盐酸小檗碱供试品溶液分别在0，2，4，6，8 h测定，盐酸小檗碱分煎、合煎样品rsd分别为0.11％、0.05％，表明盐酸小檗碱供试品溶液在8h内稳定。黄芩苷供试品溶液分别在0，2，4，6，8 h测定，黄芩苷分煎、合煎样品rsd分别为0.44％，0.28％，表明黄芩苷供试品溶液在8 h内稳定。
2.9 加样回收率实验分别精密称取已知含量的分煎、合煎样品各9份，分别加入阿魏酸、盐酸小檗碱、黄芩苷对照品溶液，照供试品溶液制备项下方法处理，制备所需溶液。照以上色谱条件测定，计算回收率，结果分煎样品、合煎样品中阿魏酸平均回收率分别为100.15%，100.98%，rsd分别为2.05%，1.95%；分煎样品、合煎样品中盐酸小檗碱平均回收率分别为99.19%，100.43%，rsd分别为0.70%，1.10%；分煎样品、合煎样品中黄芩苷平均回收率分别为96.30%，100.40%，rsd分别为0.47%、1.22%。
2.10 样品含量测定按供试品溶液制备方法分别制备样品，在上述色谱条件下测定，结果：分煎样品中阿魏酸、盐酸小檗碱、黄芩苷含量（mg/处方）分别为：5.411，360.83，227.32，rsd分别为 0.014%，0.089%，0.069%；合煎样品中阿魏酸、盐酸小檗碱、黄芩苷含量（mg/处方）分别为：2.973，225.15，90.01，rsd分别为0.021%，0.23%，0.56%。阿魏酸，盐酸小檗碱，黄芩苷出峰位置阴性对照液无干扰。对照品、样品色谱图见图1～3。
采用无重复双因素方差分析比较分煎与合煎样品间阿魏酸、盐酸小檗碱、黄芩苷含量差异，处理结果表明当归六黄汤分煎样品和合煎样品中阿魏酸、盐酸小檗碱、黄芩苷3种指标性成分含量均有显著性差异，且分煎样品中3种指标性成分平均含量均高于合煎样品中平均含量。
3 讨论
本实验采用hplc法测定当归六黄汤中3种指标性成分的含量，在文献报道［2～8］的基础上结合《中国药典》（2005版）的记载，选定适合的流动相测定该3种成分，其与杂质峰均能达到基线分离，方法简单可行，重复性好。
当归六黄汤配方颗粒汤剂中3种指标性成分的含量均高于传统汤剂中的含量，采用现代统计方法分析其所得数据，得出两种汤剂之间其含量存在着显著性差异，因为方中含有阿魏酸和盐酸小檗碱，在合煎过程中酸碱可能发生中和反应或其它化学成分间相互作用，从而影响了这3种指标性成分的溶出，但中药复方成分复杂，其原因还需作进一步深入的考察。
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