作者：楚惠媛,金建文,李海龙,李沛清,陈彻,安方玉 

【摘要】  目的 建立甘肃产当归功效的分子系统学基础,为甘肃产当归“道地性”提供分子依据。方法 采用pcr技术获得its基因,进行测序,经软件进行统计分析,计算各样本间的遗传距离。结果 甘肃岷、漳两县当归its序列差异极小,在0.000 0～0.008 3之间,岷县5个样品与漳县dg9号样品在586位都为c,589位都为t,而漳县其他3个样品在这2个位点分别为t和g。结论 its序列特征可以作为当归种间鉴别的有效分子标记,当归its序列第586位和589位2个位点碱基可能成为“岷当归”的碱基鉴别位点。

【关键词】  当归；its；序列分析；道地性；甘肃

    abstract：objective to establish the basis of molecular systematics of angelica from different areas of gansu province so as to offer molecular basis of identification gansu-produced angelica with geoherbalism. methods the its gene of angelica was obtained by pcr and sequenced to be analyzed by dnastar software to calculate the genetic distance among different specimens. results the its sequence of angelica between min county and zhang county of gansu province shows trivial differences with the range of 0.000 0～0.008 3. all 5 min county-produced angelica specimens have same bases at 586 site with “c” and 589 site with “t” with zhang county-produced angelica dg9 specimen, whereas the 586 site and 589 site bases of the other 3 zhang county-produced angelica specimens are “t” and “g” respectively. conclusion the its sequence characteristics can be recognized as effective molecular marker of angelica, and both 586 site base and 589 site base of the its sequence of angelica can be recognized as identification bases of min county-produced angelica.

    key words：angelica；internal transcribed spacer；sequence analysis；geoherbalism；gansu
 
    当归为伞形科多年生草本植物当归[angelica sinensi (oliv.)diels]的干燥根。WwW.11665.coM我国当归主产于甘肃东南部,以岷县产量多、质量好,其次为云南、四川、陕西、湖北等省,均为栽培。甘肃产的当归,个大质优,称“秦归”或“西归”,销往全国并大量出口。药材道地性研究已经成为中医药科研的重要课题,但由于道地药材与非道地药材在形态和生药上基本一致,所以传统方法亦不能满足道地药材的现代研究。道地药材是一个地域性现象,其产生除了与栽培方法、生态环境、加工方法有关外,还与物种居群的遗传特异性有关。在植物系统与进化研究中,核酸分子量是最基本的进化单位,能反映进化本质；核酸的基本序列是一元变化的,通常为点突破,趋同效应极小,以核酸分子为指标确定的系统化关系不受主观因素影响。所以,近些年分子鉴定技术在中药研究中不断应用,此方法也已成为中药材道地性研究的重要手段。its序列作为种以下分子鉴定的重要序列,其在中药道地性研究中也得到了广泛研究。

　　1  材料与方法

　　1.1  药材来源

    本试验所用药材均为2005年采自甘肃省岷县及漳县地区农民种植的当归种子,自然干燥后备用,经甘肃中医学院张西玲教授鉴定。见表1。表1  甘肃不同产地当归药材（略）

　　1.2  its序列扩增
   
　　以已经发表于genebank中的当归its序列为标准,设计一对引物,引物序列为：its正,5’-ttgtcgaatcctgcaatagc； its反,5’-tcgaagcgcacagagtatg(引物由上海生物工程技术服务有限公司合成)。pcr反应采用上海生物工程技术服务有限公司提供的即用型pcr扩增试剂盒,反应体系为50 μl,其中2×master 25 μl,上下游引物各5 μl,模板1 l,ddh2o,14 μl。pcr扩增条件：94 ℃预变性1 min,94 ℃变性1 min；53 ℃复性1 min；72 ℃延伸1 min；共35循环,72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。

　　1.3  基因组dna提取

    称取种子100 mg用医用纱布包好,置于液氮中10 min,取出后用研钵研细,用筛网过滤后称取细粉50 mg,然后按照上海生物工程技术服务有限公司生产的uniq-10柱式植物基因组dna抽提试剂盒提取,提取的基因组dna于-20 ℃保存,备用。

　　1.4  序列测定和分析
   
　　pcr产物经琼脂糖凝胶电泳检测后由上海生物工程技术服务有限公司测序,每个样品均采用双向测序。测序结果以已经发表于genebank中的当归its序列确定its序列的边界,并进行两端碱基手工修订。各序列特征采用dnastar软件进行统计分析；dna序列的用dnaman软件排序,排序后的序列采用mega4[1](molecular evolutionary genetics analysis 4)分子进化遗传分析软件,根据kimura-2参数遗传距离(kimura-2 parameter genetic distance)法计算各样品间的遗传距离值。

　　2  结果与分析

　　2.1  its长度与gc质量分数比较
   
　　本实验测得的9样品its(包括5.8s)序列中7样品为600 bp, 2样品为601 bp。所有样品5.8srdna高度一致,无碱基差异。its一区有3个变异位点,its二区有3个变异位点。各样品its序列(包括5.8s)g＋c含量范围在54.1%～54.6%之间。

　　2.2  基于its分析各样品间的遗传距离

　　(见表2)表2  各样品间的遗传距离（略）

　　3  讨论
   
　　道地药材的形成是特定的基因型,在特定的生境下受到复杂的调控,导致次生代谢过程的关键酶基因的表达产生了时空差异的结果,其形态及次生代谢产物的多样性是由基因的遗传变异引起的[2]。不少学者在研究道地药材分子机理时,都期望能找到决定道地药材的表型的关键酶基因,发现道地药材特定的基因型,但尚未取得突破性进展。its序列作为种以下一级分类群亲缘关系研究的重要基因序列,在中药材道地性研究中也得到了广泛应用。研究发现,海拔高的岷县、宕昌所产当归阿魏酸、挥发油含量显著高于漳县、渭源、定西、陇西当归,岷县当归的阿魏酸、挥发油、水溶性多糖及浸出物含量显著高于漳县产当归[3]。我们采集的9号样品来自漳县贵清山,其产地虽属漳县但因来自山体,其海拔比漳县其他3样品高,与岷县海拔及生长环境接近。我们在对岷、漳两县当归its序列研究时发现各样品间的遗传距离极小,在0.000 0～0.008 3之间,9个样品间的碱基变异位点只有6个,岷县5个样品与漳县9号样品在586位都为c,589位都为t,而漳县其他3个样品在这2个位点分别为t和g,这一结果与两地当归成分研究出现了统一性,因此,我们认为这2个位点碱基可能成为“岷当归”的碱基鉴别位点,不过其可靠性还需进一步研究证实。

【参考文献】
  　　[1] tamura k, dudley j, nei m & kumar s. mega4：molecular evolutionary genetics analysis (mega) software version 4.0[j]. molecular biology and evolution,2007,24：1596－1599.

　　[2] 黄璐琦.分子生药学[m].北京：北京大学医学出版社,2006.115－116.

　　[3] 欧阳晓玫,何英梅,朱俊儒,等.不同商品规格的甘肃当归的综合质量评价[j].中医药学报,2005,33(4)：12－14