作者：万红娇， 杨翠萍， 方芳， 叶荷平， 朱金华， 邢娟娟
【摘要】 目的研究温胆汤对盐酸阿朴吗啡（apo）诱发精神分裂症模型大鼠全血中t细胞亚群和血清中白介素2（il-2）的影响。方法采用随机数字法，将30只清洁级sd大鼠分成3组：正常组（a）、模型组（b）、温胆汤组（c），每组10只。c组于造模前采用连续灌胃温胆汤水煎剂，每次给药20 ml· kg-1(相当于灌胃20 mg·kg-1)；a和b组用等容量生理盐水灌胃。灌胃1次/d，共21 d。除a外，其它两组大鼠最后3 d给药1 h后，于左侧腹腔注射40％的apo，按5 ml·kg-1体重的剂量注射，诱发sd大鼠精神分裂症模型。a组予以生理盐水腹腔注射。最后一天造模后进行大鼠刻板行为评分，1 h后经股动脉取血，采用流式细胞仪检测t细胞亚群，双抗体夹心elisa法检测il-2。结果给温胆汤后大鼠全血中cd3+，cd4+t细胞数及cd4+/ cd8+显著比模型组高（p<0.05），各组间cd8+的差异不大(p>0.05)；血清il-2含量较模型组升高(p<0.05)；大鼠的刻板行为不同程度受到抑制（p<0.05）。结论温胆汤可以提高精神分裂症模型鼠全血中cd3+，cd4+ 亚群数和血清中il-2的含量，能有效地增强模型鼠免疫调节的能力，并具有对抗apo引起的刻板行为的作用。Www.11665.CoM
【关键词】 温胆汤； 精神分裂症； 大鼠； t细胞亚群； 白细胞介素2
chinaabstract:objectiveto explore the effect of wendan decoction (wdd) on the levels of t- cell subset and interleukin-2 (il-2) in rats with schizophrenia induced by apomorphine hydrochloride (apo).methods30 sd rats were divided randomly into 3 groups with 10 in each group: normal group, model group and wdd group. wdd group was administered intragastrically 20 ml per kg wdd ; the other groups were administered the same volume of sodium chloride. the 3 groups were given drugs.i.d for 21 days. except the normal group, the other groups were given 40% apo with sinistro-intraperitoneal injection to set the schizophrenia model after 1 hour of intragastrical administration in the last 3 days. the dosage was 5ml per kg. after the last day of setting model, the stereotyped behavior scores of rats were recorded. after 1 hour, the blood were sampled from arteria femoralis, then the levels of t- cell subset and interleukin-2 (il-2) were measured by flow cytometer (fcm) and double antibody sandwich elisa respectively.resultsthe levels of cd3+ and cd4+t cell and cd4+/ cd8+ were increased remarkably in wdd group, compared with model group (p<0.05). the differences of cd8+ level between the groups were not obvious (p>0.05); the level of il-2 in wdd group was higher than that of model group (p<0.05); the stereotyped behavior of rats was inhibited in different degrees (p<0.05).conclusionwdd can increase the levels of cd3+, cd4+t cell subset and il-2 in rats with schizophrenia, reinforce the immune function of rats effectively and also has the anti - effect to the stereotyped behavior induced by apo.
key words:wendan decoction; schizophrenia; rat; t- cell subset; interleukin-2
温胆汤是一首化痰经典名方，临床用治“无形之痰”所致的精神疾患，疗效得到肯定［1,2］。本实验从精神分裂症多巴胺(da)功能亢进的发病机制探讨温胆汤的作用及其作用机理，从行为学、免疫等方面，观察温胆汤对精神分裂症模型鼠体内t细胞亚群、白细胞介素-2（il-2）的影响,证实其免疫调节的作用，为临床广泛应用提供参考。
1 材料
1.1 动物与分组清洁级sd大鼠，雌性，(200±20)g，30只，由江西中医学院实验动物中心提供，饲养环境温度(25±1)℃，自然光照，给予充足的饮水和摄食，适应5 d后开始实验。随机分为3组：正常组、模型组、温胆汤组，每组10只。
1.2 药物与试剂
1.2.1 中药汤剂制备温胆汤组方(剂量以我们前期临床、实验研究剂量为依据)：半夏10 g，茯苓30 g，竹茹10 g，枳实10 g，陈皮10 g，甘草6 g，每剂含生药76 g，由江西省中医院中药房提供。经鉴定合格，各药物先加水浸泡30 min，一煎加药材量的8倍的水，沸腾后煎40 min，过滤取汁，二煎加药材量的6倍的水，沸腾后煎30 min，过滤两煎所得滤液混合后浓缩成1∶1，4℃冰箱保存备用。
1.2.2 试剂盐酸阿朴吗啡（apo），美国sigma 公司生产。异硫氰酸荧光素标记的单克隆抗体（fitc）标记小鼠抗大鼠cd3单克隆抗体，藻红蛋白(pe)标记小鼠抗大鼠cd4单克隆抗体,多藻叶绿素蛋白（perccp）标记小鼠抗大鼠cd8 单克隆抗体，红细胞裂解液，均为美国caltag公司产品；白介素-2试剂盒（elisa法），美国原装进口，上海天呈科技有限公司提供；pbs缓冲液。
1.3 仪器流式细胞仪：美国bd公司facscalibur型，氰离子激光器，激发光波长488 nm，分析软件为cell quest软件；高速离心机（tdl-40b）,上海安亭科学仪器厂生产；mk3酶标仪：labsystem产品。
2 方法
2.1 给药方法［3］温胆汤组于造模前采用连续灌胃给药，每次给药20 ml·kg-1(相当于灌胃20 mg·kg-1)；正常组和模型组用等容量生理盐水灌胃。灌胃1次/d，共21 d。
2.2 动物模型的建立［4］动物适应饲养环境5 d后进行实验，给药21 d，除正常组外，其它两组大鼠最后3 d给药1 h后，左侧腹腔注射40％的apo，按5 ml·kg-1体重的剂量注射，诱发sd大鼠精神分裂症模型。正常组予以生理盐水腹腔注射。
2.3 观察指标
2.3.1 一般情况实验期间观察记录动物行为活动、外观体征、粪便性状等。
2.3.2 刻板行为评分［5］每组大鼠均于末次给药1 h后腹腔注射apo后观察刻板行为，每隔10 min评分1次，共观察60 min。其评分级别见表1。表1 刻板行为评分（略）
2.3.3 血液指标测定最后1次造模1 h后处死大鼠，股动脉剪开取全血和血清测定t细胞亚群数和il-2的含量。选用流式细胞仪检测，应用cell quest分析软件，阳性峰细胞荧光强度作为t淋巴细胞表面分子cd3，cd4和cd8 的表达量。 采用双抗体夹心elisa法，按说明书操作测定il-2含量。
2.4 统计学处理实验数据以±s表示，应用spss13.0统计软件先进行正态性检验和方差齐性检验，呈正态分布且方差齐同则应用单因素方差分析（one-way anova）及两两q检验；呈偏态分布或方差不齐则作多组样本秩和h检验，进而作秩和q检验。
3 结果
3.1 一般情况整个给药期间未见动物死亡，造模前大鼠行为活动未见异常，外观体征、粪便性状均正常。
3.2 刻板行为评分结果模型组10只大鼠造模后均出现了闻、咬、舔等刻板行为，活动十分明显，而正常组大鼠无此运动，比较后差异有统计学意义（p<0.05），说明造模成功。与模型组比较，温胆汤组大鼠刻板行为在20 min后受到抑制（p<0.05）。说明温胆汤具有对抗apo引起的刻板行为的作用。见表2。表2 各组大鼠的刻板行为评分（略）
3.3 血液检测结果
3.3.1 t细胞亚群检测从表3可见，模型组全血中cd3+,cd4+t细胞数及cd4+/ cd8+比例显著比正常组和温胆汤组低，各组间cd8+的差异不大；使用温胆汤组大鼠的cd3+，cd4+t细胞数及cd4+/ cd8+比例比模型组显著升高。表3 各组大鼠全血cd3，cd4，cd8，cd4/cd8的比较（略）
图1为流式细胞仪检测的各组大鼠全血中t细胞亚群cd3+，cd4+和cd8+的比例的代表图。图中的上、中、下图分别为正常组、温胆汤组、模型组大鼠全血中的cd3+，cd4+和cd8+所占的比例。
3.3.2 il-2检测表4显示，模型组大鼠血清il-2含量较正常组和温胆汤组降低，而温胆汤组il-2含量较模行组升高，提示温胆汤可通过提高il-2含量来增强机体的免疫功能。表4 各组大鼠血清il-2的比较（略）
4 讨论
精神分裂症是一种较常见的精神疾病，具有思维、情感、行为等多方面的障碍，以精神活动与环境不协调为特征。目前,临床治疗精神分裂症的西药有酚噻嗪类、硫杂蒽类、丁酰苯类、苯酰胺类等化合物，在治疗过程中易出现锥体外系不良反应和镇静、体位性低血压与植物神经紊乱的不良反应，且对慢性迁延病程者疗效不佳。因此，探索疗效好、副作用小的抗精神分裂症的中草药甚为迫切。目前国内尚未有人开展有关中药配伍治疗精神分裂症的基础实验研究，温胆汤对精神分裂症模型鼠免疫调节的实验是我们系统研究中的一部分。
现代研究发现精神分裂症的发病与脑内多巴胺（da）功能亢进密切相关，给予动物da受体激动剂apo后，动物出现反复、刻板行为，如不停的嗅、舔、咬和运动增多等行为，它是脑内中脑-边缘和中脑-皮层da系统兴奋的表现，观察药物抗刻板行为的强弱可以推论它对精神疾病的治疗效果。
本实验用apo造模诱发sd大鼠精神分裂症模型，表1可以看出未治疗的模型组大鼠全部出现明显的刻板行为，大鼠连续咬、啃、舔，有时全身迅速移动。而使用温胆汤组大鼠刻板行为在20 min后受到抑制，说明温胆汤具有对抗apo引起的刻板行为的作用。而apo之所以能引起刻板行为的发生是由于da大量与受体结合导致da功能亢进，温胆汤在阻止da与受体结合方面发挥了作用，从而抑制了刻板行为。
t淋巴细胞的主要功能是介导细胞免疫，调节机体的免疫功能，arolt-v等［6］研究精神分裂症患者外周血中的t细胞因子系统，发现白细胞介素-2（il-2）比正常对照组要显著降低，可溶性的il-2受体显著升高。il-2被称作“t细胞生长因子”，是t淋巴细胞经过有丝分裂或抗原性刺激后产生的一种糖基化蛋白，它可以提高细胞分泌和细胞分化，il-2的降低说明病人存在细胞免疫的降低。
cd4+t细胞对机体的细胞免疫及体液免疫功能都有辅助性作用，根据cd4+th细胞所分泌的细胞因子不同，将其分为th0，th1和th2三种亚型。 th1细胞偏向于分泌il-2，γ-干扰素（ifn-γ），它与tdht细胞和tc细胞的增殖、分化与成熟有关，因此th1细胞可促进细胞介导的免疫应答，所以，我们推测，辅助性t淋巴细胞cd4+t细胞的降低势必引起th1细胞的降低，而th1细胞所分泌的il-2及ifn-γ也应相应降低，而许多文献报道精神分裂症病人外周血中il-2也是降低的，我们认为，精神分裂症体内可能存在细胞免疫的抑制现象，这种抑制现象主要是由辅助性t淋巴细胞cd4+t细胞降低引起的。一般来说，机体免疫应答过程首先由抗原递呈细胞如巨噬细胞，将加工处理的抗原分子递呈给cd4细胞，使其在一系列细胞因子作用下活化，产生对b细胞的辅助效应，促进体液免疫。
本研究的结果显示在精神分裂模型鼠的外周血中，代表全体t淋巴细胞的cd3+t细胞、辅助t淋巴细胞cd4+t细胞及cd4+/cd8+t细胞比值都较正常对照组显著降低；抑制性t淋巴细胞cd8+t细胞变化无显著意义。这一结果同国内的大部分研究结果比较一致，且免疫功能的低下以辅助性t淋巴细胞cd4+t细胞的低下为主。同时本实验也发现模型组大鼠体内的il-2含量明显减少，而使用温胆汤组il-2的含量增高，表明温胆汤能提高模型鼠体内cd3+、cd4+的比例，增加cd4+/ cd8+比值及il-2的含量，具有增强整体免疫功能的作用。提示温胆汤的作用机理可能是促使某一特定的t细胞群体的克隆性扩增，通过th细胞数目及功能的提高来增强整体的免疫功能。
【参考文献】
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［4］徐淑云.药理实验方法学［m］.北京：人民卫生出版社,2001：856.
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［6］arolt v,rothermundt m,wandinger kp,etal.decreased in vitro production of interferon-gamma and interleukin-2 in whole blood of patients with schizophrenia during treatment［j］.mil-psychiatry ,2000,5(2):150.
