作者：李加林，刘丽华，吴素珍，范启兰，陈水亲
【摘要】 目的探讨兔儿伞乙醇、丙酮、醋酸乙酯、水提取物体外抗氧化能力。方法利用微波辅助提取法分别得到了兔儿伞乙醇提取物、丙酮提取物、醋酸乙酯提取物和水提取物，采用fonton反应体系产生羟基自由基和邻苯三酚自氧化产生超氧阴离子自由基。结果4种提取物对羟自由基、超氧阴离子自由基(o2- ·)均有清除作用，其中以乙醇提取物的效果最佳。结论兔儿伞可作为抗氧化物质资源，有一定的开发利用价值。
【关键词】 兔儿伞； 自由基； 抗氧化活性
自由基(free radical) 也称活性氧，很多情况下，它都缺少一个电子，处于不稳定的状态。不稳定的自由基会从周围的物质中夺取电子配对，这种行为就是自由基的氧化作用。被夺走电子的物质，又去抢夺其它物质的电子。就这样，争夺电子的连锁反应逐渐扩散到各处，细胞一个一个被氧化，从而失去了其正常功能。越来越多的科学研究证实自由基是人体疾病和衰老的直接制造者。人只要活着，自由基就在不断生成。自由基一旦大量产生，超过身体内酶所能处理的程度，人的健康就会亮起红灯，出现癌症、动脉硬化、糖尿病、白内障、风湿性关节炎、巴金森氏症等多种疾病［1］。WWW.11665.CoM动物实验也指出，寿命的长短与自由基的产生及人体内抗氧化剂的浓度确实有密切的关联；流行病学与临床研究报告也显示，如果人体内有足够的抗氧化剂，则可降低多种疾病的罹患几率。然而研究发现，合成抗氧化剂对人体具有潜在的威胁，如bha可造成大鼠前胃增生、乳状瘤甚至癌变，在日本已被禁用;bht能使人的wl-38胚胎细胞分裂后期发生阳性的染色体异常，甚至导致死亡，因此在美国和日本已经停止使用。随着消费者自身健康意识的提高，天然抗氧化剂日益受到重视［2～4］。因此，研究开发广谱、高效、安全的天然抗氧化剂，已经成为当今的研究热点之一。
兔儿伞syneilesis aconitifolia (bunge) maxim.为菊科兔儿伞属多年生草本植物［5］，含有黄酮、维生素、多糖等多种保健活性成分和营养成分，其嫩叶和幼苗在我国民间许多地方都作为一种药食两用食品，很受欢迎［6］。研究表明兔儿伞中黄酮类化合物及生物碱含量较高［7，8］，现代药理学对其抗炎镇痛作用进行了探讨［9］，而对兔儿伞进行自由基清除的抗氧化研究未见报道，本文首次对兔儿伞提取物（水提取物、乙醇提取物、丙酮提取物和醋酸乙酯提取物）的抗氧化活性进行了探讨，以期为兔儿伞作为一种天然的抗氧化物得到推广和利用。
1 材料与仪器
1.1 材料
兔儿伞由安徽师范大学张中信老师于2007-06采自安徽黄山，经安徽师范大学张小平教授鉴定为兔儿伞syneilesis aconitifolia (bunge) maxim.。
1.2 仪器与试剂
wf-4000微波快速反应系统（上海屹尧分析仪器有限公司）；uv1900ppc紫外可见分光光度计（上海亚研电子科技有限公司）；电子天平(北京赛多利斯天平仪器厂)。所有试剂均为分析纯。
2 方法
2.1 兔儿伞不同溶剂提取物制备将一定量的兔儿伞干燥粉末置于微波反应釜中，分别以水、乙醇、丙酮、醋酸乙酯为溶剂，料液比为1∶60，微波功率800 w，提取3次，15 min/次，合并提取液，减压浓缩，真空干燥备用。
2.2 羟自由基(·oh)的清除能力采用亚铁离子催化h2o2产生·oh(fonton反应)的方法［10，11］。取0.75 mol/l邻二氮菲溶液l ml，pbs液2 ml和蒸馏水1 ml，充分混匀后，加0.75 mmol/l硫酸亚铁i ml，混匀，加0.01%的h2o2 l ml，37℃水浴60 min，以pbs液调零，536 nm处测定吸光度，其值记为ap；用l ml蒸馏水代替l ml h2o2，以pbs调零，测得吸光度记为ab；用1 ml试样代替1 ml蒸馏水，以同浓度不加h2o2 的加试样管调零，测得吸光度记为as。·oh清除率(d%)计算公式: d(%)=(as-ap)/(ab-ap)×100%。
2.3 超氧阴离子自由基(o2- ·)清除能力取0.05 mol/l ph 8.2的tris一hcl缓冲液4.5 mol于试管中，置25℃水浴预热20 min，加入供试样品0.1ml，2.5 mmol/l邻苯三酚0.4 ml，混匀后在25℃水浴反应4 min加8 mmol/l盐酸两滴终止反应，（299±1）nm处测定吸光度，空白组以0.1 ml蒸馏水代替供试样品，并按下式计算清除率［12］。d%= (a空白-a样品)/a空白×100%。
3 结果
3.1 不同溶剂提取物对羟自由基的清除作用兔儿伞不同溶剂提取物对·oh的清除作用如图1所示。乙醇提取物对羟自由基清除率的回归方程是: y= 1.576 79+ 13.629 04x（r= 0.996 69）， 丙酮提取物对羟自由基清除率的回归方程是：y=0.43101 + 9.935 53x（r= 0.999 8），水提取物对羟自由基清除率的回归方程是y=0.007+5.033 5x（r=0.997 36），醋酸乙酯提取物对羟自由基清除率的回归方程是y= 6.729+5.614 5x（r=0.969 9），由回归方程可求出兔儿伞的乙醇、丙酮、水、醋酸乙酯提取物对·oh清除率为50%时的提取物浓度（ic50）分别为：3.55，4.99，9.93，7.70 mg/ml 。由此可见，4种溶剂提取物对羟自由基均有一定的清除作用，其中乙醇提取物对羟自由基的清除效果最好。
3.2 不同溶剂提取物对超氧阴离子自由基的清除作用兔儿伞不同溶剂提取物对o2- ·的清除作用如图2所示。乙醇提取物对超氧阴离子自由基的清除率回归方程是: y= 1.972 04+14.423 11x（r=0.996 5）， 丙酮提取物对超氧阴离子自由基的清除率回归方程是：y=3.492 98 + 10.304 75x（r=0.992 44），水提取物对超氧阴离子自由基的清除率回归方程是y=6.24x-1.02（r=0.999 08），醋酸乙酯提取物对超氧阴离子自由基的清除率回归方程是y= 8.748+6.823x（r=0.971 74），由曲线方程可求出兔儿伞的乙醇、丙酮、水、醋酸乙酯提取物对超氧阴离子自由基的清除率为50%时的提取物浓度分别为：3.33，4.51，8.18，4.94 mg/ml。由此可见，兔儿伞4种提取物对超氧阴离子都有一定的清除作用，其中乙醇提取物对超氧阴离子自由基的清除效果最好。图2 兔儿伞不同溶剂提取物对超氧阴离子自由基的清除作用
4 讨论
人体内的氧自由基如游离羟基、超氧阴离子等的过量产生，是人体细胞衰老凋亡和癌变的重要原因。·oh是毒性最大的活性氧，它可以加成至碱基双键中，破坏碱基，从而破坏细胞内dna的结构，导致基因突变［13］。研究发现黄酮类物质、花色苷等可作为抗氧化药物对心血管起保护作用［14］。研究发现兔儿伞4种提取物均有一定的清除o2 ·和·oh的作用，这可能与其含有的黄酮类化合物有关，其中乙醇提取物对自由基的清除效果最好，可能是因为以乙醇为提取剂时其中黄酮类化合物含量最高所致。因此，兔儿伞作为一种潜在的抗氧化功能食品有待进一步深入研究。
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