作者：田志杰， 吕世杰， 姜艳霞， 王程， 罗君， 李妍

【摘要】  目的用正交法优选木耳粗多糖的提取工艺及其对血清超氧化物歧化酶（sod）及肝脏体外脂质过氧化的影响。方法选取料水比、温度、提取次数以及提取时间为考察因素，采用正交法l9（34）为方案，确定木耳粗多糖提取的最佳工艺。按15 mg·kg-1·d-1(为人类摄取木耳中木耳多糖的10倍)给wistar大鼠灌胃，血清中sod活性和肝脏中的丙二醛（mda）含量分别采用邻苯三酚自氧化和tba法测定。结果木耳多糖的最佳提取条件是：料水比为1∶45，提取温度为80℃，水提时间1 h，提取次数3次，得率4.37%；灌胃大鼠较空白组肝脏的mda含量明显下降（p<0.05）；血清sod活性对邻苯三酚自氧化抑制率明显提高(p<0.05)。结论优化条件可提高木耳粗多糖产率,并保证较高多糖的含量和安全性；木耳多糖应用于抗衰老和保肝作用前景良好。

【关键词】  木耳多糖； 正交法； 超氧化物歧化酶； 丙二醛

木耳auricularia auricula （l.） underw，别名黑木耳、光木耳。真菌学分类属担子菌纲，木耳目，木耳科，是药食两用的物品。wWW.11665.cOm分布广泛，人工培育产量高，具有良好的深加工前景。木耳子实体富含多糖胶体，有良好的清滑作用，是矿山工人、纺织工人的重要保健食品。木耳多糖具有多种生物活性，对细胞免疫和体液免疫功能具有良好的促进作用；具有降低血脂、胆固醇、血液黏度，抗血栓形成作用；具有降低血糖、抗糖尿病的功能；同时还能促进核酸、蛋白质的生物合成和防治多种老年性疾病［1］。
    
　　为了提高木耳多糖提取的科学性和产率，采用正交实验优选其提取工艺的最佳条件，并研究其对血清sod及肝脏脂质过氧化的影响。

　　1  仪器与材料
    
　　电子天平；hh-601超级恒温水浴；gys-2不锈钢电热恒温水浴箱；hzq-c空气浴震荡器；gzx-dh-50x55-s电热恒温干燥箱；双蒸水器；t6 新世纪紫外分光光度计；721可见分光光度计；ph计；粉碎机等；所有试剂均为分析纯。
    
　　木耳购自本市超市，产地吉林蛟河。
    
　　wistar大鼠，雌性，体质量(200±20)g，购自吉林大学基础医学院，许可证号：scxk-（吉）2003-001。

　　2  方法与结果

　　2.1  因素及水平考察根据前期摸索实验得知木耳的粒度决定料水比例，粒度越小，黏度越低。将木耳磨成粉状，在粒度固定的情况下，采取相同的浸泡时间，影响提取的主要因素有料水比、温度、提取次数以及提取时间。每个因素选择3水平，进行正交实验设计l9（34）［2］，考察上述4个因素对木耳多糖提取效率的影响，实验因素水平如表1所示。表1  变量因素及相应水平（略）

　　2.2  提取方法取木耳子实体10 g，按l9（34）正交表设计方案进行实验，蒸馏水煎煮，合并煎液，过滤，滤液浓缩至50 ml，sevag法脱蛋白3次，根据木耳粗多糖的分子量选择10 000～12 000的透析袋，蒸馏水透析3 d，浓缩后，用2倍于浓缩液的无水乙醇进行醇沉，根据乙醇的挥发温度在80℃水浴下挥干，得灰白色片状物。蒽酮法测定多糖含量。正交结果见表2。
    
　　结合对正交实验数据的分析可得出提取工艺为a2b2c1d3，即料水比为1∶45，水提温度为80℃，水提时间为1 h，水提次数为3次。根据极差值可知，各因素对提取率影响的大小依次为水提次数、水提时间、料水比和水提温度。表2  正交实验产率及spss13.0得到的预测产率（略）

　　2.3  木耳粗多糖中糖含量的测定

　　2.3.1  对照品溶液的制备称取105℃干燥至恒重的葡萄糖0.102 0 g，置于100 ml容量瓶中，分别吸取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6 ml定容至10 ml，即得不同浓度的标准液。

　　2.3.2  样品溶液的制备分别精密称取不同条件下提取的木耳粗多糖10 mg，置于100 ml的容量瓶中，80℃恒温水浴溶解，定容，即得样品。

　　2.3.3  绘制标准曲线分别取不同浓度标准液2 ml，加入2%的蒽酮-硫酸试剂（内含1%硫脲，下同）5 ml，沸水浴中加热10 min，取出后流水冷却，在620 nm波长下比色，得回归方程：y=6.880 4x+0.001， r2 =0.991 4 ， 浓度与a值所做标准曲线如图1。

　　2.3.4  样品中糖的含量的测定精确称取不同条件下木耳粗多糖1 ml+1 ml h2o，加入2%的蒽酮-硫酸试剂5 ml，沸水浴中加热10min，取出后流水冷却，在620 nm波长下比色（见表3）。木耳粗多糖中平均总含糖量为50.1%。表3  木耳多糖含量（略）

　　2.4  木耳多糖对血清sod及肝脏体外脂质过氧化的影响wistar大鼠10只，购回后在紫外消毒、温度23℃的室内自由喂清洁级大鼠专用饲料和水进行1周的适应性饲养后，随机分空白组和药物组，药物组每天给予1.5 ml浓度为1%的木耳多糖溶液（按15 mg/kg体重,为人类摄取木耳中木耳多糖的10倍），5 d后乌拉坦麻醉，腹主动脉取血并取肝脏。

　　2.4.1  对血清sod的影响血清sod的制备及sod测定液的配制［3］，取0.4 ml血清，加入0.4 ml乙醇-氯仿混合液（两者体积比为5∶3），振荡2 min，4 000 r/min离心5 min以除去蛋白质，上清液为sod抽提液。试剂及反应条件：取3支试管，分别为对照管、样品管1和2（正常和药物实验动物血清）。反应条件如下：样品管分别取sod 抽取液100 μl，加入4.8 ml的ph 8.2tris-hcl缓冲液（含0.1 mmol/edta），对照管加入4.9 ml的ph8.2tris-hcl缓冲液（含0.1 mmol/edta），混匀，在25℃恒温水浴中保存10 min后各加入6 mmol/l邻苯三酚100 μl，邻苯三酚加入后，摇匀，5 min内测定对照管和样品管的吸光率a对照和a样品，测定波长为320 nm，利用邻苯三酚法测定sod抽取液的a值并计算抑制率。抑制率越高，sod活性越高，否则相反。实验结果的值进行t检验。结果见表4。
    
　　抑制率i（%）=（△a对照-△a样品）/△a对照×100%
    
　　实验结果的值进行t-检验。结果见表4。表4  木耳多糖对邻苯三酚自氧化的影响（略）

　　药物空白组与正常组比较,p=0.013<0.05；n=5

　　2.4.2  对肝脏体外脂质过氧化的影响［4］试剂及反应条件：分别为对照、样品管1和2（正常和药物实验动物血清）。样品管分别取测定mda的肝匀浆1.0 ml于试管中，再加入蒸馏水1 ml，对照组取蒸馏水2 ml代替，混匀后于37℃空气恒温浴震荡器中振荡1.5 h，取出后加入10%的三氯醋酸2.0  ml，0.67%tba 1.0 ml，混匀后在沸水浴中反应15 min，取出后流水冷却，以3 000 r/min离心15 min，其上清液在532 nm波长处比色，测定a值，计算对mda的抑制率，此间接反应实验条件对肝脏mda的影响。实验结果的值进行t-检验。结果见表5。　表5  木耳多糖对体外肝脏脂质过氧化的作用（略）
    
　　抑制率i（%）=（a对照-a样品）/a对照×100%

　　3  讨论
    
　　本实验的提取剂采用蒸馏水，尽管木耳粗多糖得率低于酸碱及各种酶参与的提取，但环保且提取的木耳多糖没有有害物质的残留，而且含糖量比较高，适合应用于保健及治疗过程。
    
　　通过正交实验对木耳多糖的提取工艺条件进行优化，在料水比为1∶45、水提温度为80℃，水提时间为1 h，水提次数为3次的条件下比批量生产木耳多糖的产率高出3～5倍。根据极差值看出，提取温度对得率影响最小，可以降低温度，节省资源。
    
　　对wistar大鼠灌胃结果表明：木耳多糖不仅可以显著提高血清sod的活性（p<0.05），通过血液循环清除全身各处的超氧阴离子，达到抗衰老的目的，也可以明显降低肝脏mda的含量（p<0.05），保护肝脏。

【参考文献】
  　　［1］季宇彬.中药多糖的化学与药理［m］.北京：人民卫生出版社，2005：382.

　　［2］余松林.医学统计学［m］.北京：人民卫生出版社，2002.

　　［3］zhaojing wang,dianhui luo,cai ena，et al. optimization of polysaccharides extraction from gynostemma pentaphyllum makino using uniform design［j］.. carbohydrate polymers(2007) dio:10:1016/j.carbpol，2006，10：3.

　　［4］赵云斌，刘 敏，余忠谊. 邻苯三酚自氧化法测定血中超氧化物歧化酶的活性［j］.中国卫生检验杂志，2006，11（4）：387.