作者：李超，孙秀梅，张兆旺，李军伟，于定荣，窦锦明

【摘要】  目的比较香附经二氧化碳超临界流体萃取（sfe-co2）后药渣的5种方法提取液（sbe液、we液、ae液、sbae液 、wae液）对兔离体肠平滑肌的影响。方法以兔离体肠平滑肌收缩频率、幅度和张力为指标，采用bl-420e+生物机能实验系统，比较香附sfe-co2后药渣的5种方法提取液对正常及乙酰胆碱作用下的兔离体肠平滑肌的作用。结果香附sfe-co2后药渣的5种方法提取液均能显著降低正常兔离体肠运动的频率和张力 (p<0.05)；降低乙酰胆碱作用下离体肠管的幅度及张力(p<0.01)；其中sbe提取液与其他提取液相比，表现出更强的抑制作用(p<0.05)。结论香附sfe-co2后药渣的5种方法提取液对兔离体肠平滑肌均具有抑制作用，其中sbe提取液的作用最强。

【关键词】  香附sfe-co2后药渣； 5种方法提取液； 兔离体肠平滑肌

  chinaabstract：objectiveto compare the post carbon dioxide supercritical fluid extraction (sfe-co2) effects of 5 kinds of drug extracts (sbe liquid,we liquid,ae liquid,sbae liquid,wae liquid) rhizoma cyperi on the movement of in vitro intestine smooth muscle in drug.methodsthe contractive amplitude, frequency, and tension of the normal and acetylcholine-induced rabbit intestine smooth muscle were recorded with bl-420e+ biological and functional experimental system.resultsrhizoma cyperi drug extracts could significantly reduce the frequency and tension of the normal rabbit intestine smooth muscle(p<0.05), depress the contractive amplitude and tension of intestine smooth muscle after acetylcholine induced hyperkinesias(p<0.01),in which the sbe extract group had the greatest effect (p<0.05). conclusionall the rhizoma cyperi drug extracts can restrain the movement of rabbit intestine smooth muscle in vitro, and the effect of sbe group is the greatest than the other four groups.

　　key words：rhizoma cyperi drugs after sfe-co2;  5 kinds of methods extracts;  rabbit ex vivo intestine smooth muscle
   
　　香附为莎草科植物莎草cyperus rotundus l.的干燥根茎，主产于山东、浙江、湖南、河南等地。WWW.11665.COM本品有行气解郁，调经止痛之功效，用于治疗肝郁气滞，胸、胁、脘腹胀痛，消化不良，胸脘痞闷，寒疝腹痛，乳房胀痛，月经不调，经闭痛经等症［1］。李时珍称其为“气病之总司，女科之主帅”。现代研究表明，香附具有解痉作用，能治疗胃腹疼痛或胸腹痛［2］。香附水提液能明显抑制离体兔肠平滑肌的收缩幅度与频率，同时也能拮抗乙酰胆碱和氯化钡所致离体肠管平滑肌的兴奋作用［3］。为优选香附经二氧化碳超临界流体萃取（sfe-co2）后药渣的提取方法和提取工艺，本文在对香附5种方法提取液（sbe液、we液、ae液、sbae液 、wae液）成分比较的基础上，进一步对兔离体肠平滑肌的影响进行比较。

　　1  材料

　　1.1  仪器与药品

　　phs-3c型精密ph计 (上海雷磁仪器厂)，lxj-ⅱ型离心沉淀机（上海医疗器械三厂），fa-1104型电子天平（上海精密仪器厂），bl-420e+型生物机能实验系统（四川成都泰盟电子公司），恒温平滑肌浴槽（张家港市南港医疗器械厂），ft-100生物张力传感器(成都泰盟电子有限公司)。氯化乙酰胆碱（国药集团化学试剂有限公司，批号：6900282），氯化钠(青岛化学试剂厂，批号：050616)，氯化钾(河南焦作市化工三厂，批号：990911)，无水氯化钙(天津市广成化学试剂有限公司，批号：20020504)，碳酸氢钠(山东省化工研究院，批号：990902)，葡萄糖(青岛化学试剂厂，批号：040716)，mgso4·7h2o（开原化学试剂厂，批号：990201），nah2po4·2h2o（天津市科密欧化学试剂开发中心，批号：030828），皆为分析纯。
   
　　香附饮片系莎草科植物莎草cyperus rotundas l.的干燥根茎，在安徽沪谯中药饮片厂，经炮制规范化研究加工成的规范饮片，用sfe-co2萃取后药渣备用。

　　1.2  动物新西兰大白兔，雌雄不限，体质量（2.2±0.5）kg，由山东中医药大学动物室提供，合格证号：scxk(鲁)20050015。

　　1.3  供试液的制备

　　1.3.1  半仿生提取液的制备准确称取超临界提取后的香附药渣100 g，加水提取3次，加水量依次为香附的10倍，6倍，6倍；水的ph依次为2.0，6.5，9.0；煎煮时间依次为2，1，1 h；3煎液分别离心，合并上清液，浓缩并定容至200 ml，即得sbe液（香附药渣的质量浓度为0.5g·l-1）。

　　1.3.2  水提取液的制备按“1.3.1”项下方法，只将3煎用水改为常水（ph=7.0），依法操作，即得we液（香附药渣的质量浓度为0.5 g·l-1）。

　　1.3.3  醇提取液的制备按“1.3.1”项下方法，只将3煎用水改用55%乙醇，提取3次，依法操作，即得ae液（香附药渣的质量浓度为0.5 g·l-1）。

　　1.3.4  半仿生醇沉液的制备取“1.3.1”项下sbe液100 ml，加入计算量的乙醇，使含醇量达55%，边加边振摇，4℃静置24 h，离心（2000 r·min-1，30 min），取上清液，浓缩并定容至100 ml，即得sbae液（香附药渣的质量浓度为0.5 g·l-1）。

　　1.3.5  水提醇沉液的制备取“1.3.2”项下we液100 ml，加入计算量的乙醇，使含醇量达55%，边加边振摇，4℃静置24 h，离心（2000 r·min-1，30 min），取上清液，浓缩并定容至100 ml，即得wae液（香附药渣的质量浓度为0.5 g·l-1）。

　　1.4  台氏液的配制准确称取nacl  8g，kcl  0.2g，mgso4·7h2o  0.26g，nah2po4·2h2o 0.065g，nahco3  1g，cacl2  0.2g，葡萄糖 1g，先将cacl2用蒸馏水溶解完全，再加入其余6种物质溶解，转移至容量瓶中，用蒸馏水定容至1000 ml。

　　2  方法与结果

　　2.1  对正常兔离体肠运动的影响［4，5］取禁食24 h家兔，用槌猛击其后枕部，使其暴死，迅速打开腹腔，找出胃和十二指肠交界处，用线结扎，在结扎线近胃侧剪断小肠，去除肠壁周围肠系膜，分离出长约20～30 cm的肠管，立刻置于4℃的台氏液中，剪成2～3 cm的肠段，并用台氏液把肠内容物冲洗干净，以备用。
   
　　打开bl-420e+生物机能实验系统，调零，定标，安装拉力换能器，设置参数为：增益调节g=50，时间常数t﹦dc，滤波调节f﹦30 hz，扫描速度s﹦16.00 s/div。
   
　　取标本，两端对角穿线，将其放在盛有50ml台氏液的恒温浴管（温度保持为37℃）中，上端连接拉力换能器，下端系于l型钩上固定，同时每分钟通入混合气60～80个气泡。标本负荷1～2 g，平衡30 min，待实验系统稳定后，描记肠段自发性舒缩稳定后的肠管正常运动曲线。在实验过程中，描记正常舒缩曲线后，向浴槽中加入各种药液，给药量1 ml，描记舒缩曲线。完成后，立即用新鲜台氏液冲洗2～3次，待肠段舒缩恢复正常后才可进行下一次给药，无法恢复正常舒缩的肠段弃去；用区间测量法测量给药前1 min及给药后第5 min的频率、幅度及张力，按公式①～③计算频率抑制率、幅度抑制率、张力抑制率，求平均值。用统计软件spss17.0作组内配对t检验，组间方差分析比较。结果见表1～3。表1  5种方法提取液对正常兔离体肠平滑肌频率的影响(略)表2  5种方法提取液对正常兔离体肠平滑肌幅度的影响(略)表3  5种方法提取液对正常兔离体肠平滑肌张力的影响(略)

　　频率抑制率（%）=给药前频率-给药后频率给药前频率×100%①

　　幅度抑制率（%）=给药前幅度-给药后幅度给药前幅度×100%②
 
　　张力抑制率（%）=给药前张力-给药后张力给药前张力×100%③

　　2.2  对ach所致兔离体肠痉挛的影响标本制备方法及仪器调试同“2.1”下项。描记一段正常肠平滑肌自律曲线后，向浴槽中加入0.01％乙酰胆碱0.1 ml，然后加入各种提取液，给药量1ml，描记舒缩曲线。计算其频率、幅度及张力的抑制率后，组内配对t检验，组间方差分析比较。结果见表4～6。表4  5种方法提取液对ach作用下兔离体肠平滑肌频率的影响(略)表5  5种方法提取液对ach作用下兔离体肠平滑肌幅度的影响(略)表6  5种方法提取液对ach作用下兔离体肠平滑肌张力的影响(略)

　　3  讨论

    本实验根据中药半仿生提取法（简称：sbe法）“有成分论，不唯成分论，重在机体药效学反应”的理论，对香附经sfe-co2后的药渣，分别制备sbe、sbae（半仿生提取醇沉）、we（水提取）、wae（水提取醇沉）、ae（醇提取）提取液，以这5种方法提取液对兔正常离体肠平滑肌运动的幅度、张力、频率的抑制作用同空白组比较，结果均具有显著性差异(p<0.05)。提示在与中枢神经、体液调控脱离的条件下，5种方法提取液对离体肠平滑肌有显著的抑制作用。sbe组与sbae、wae、we、ae组相比有显著性差异(p<0.05)，表明sbe法提取液对离体肠平滑肌运动的抑制作用最强。

    乙酰胆碱是平滑肌内兴奋传递的化学物质，能激动胆碱能受体，兴奋胃肠道，使其收缩的幅度及张力增加。本实验中香附经sfe-co2后药渣的5种方法提取液对乙酰胆碱作用下离体肠平滑肌张力、幅度的抑制作用均具有非常显著性差异(p＜0.01)，5 种方法提取液对乙酰胆碱作用下平滑肌频率的抑制作用，除sbae法提取液同空白组相比无显著性差异外（p＞0.05），其余4组均具有显著性差异(p＜0.01)，表明香附经sfe-co2后药渣的5种方法提取液对兔离体肠痉挛有显著的抑制作用。    本实验结果表明，香附经sfe-co2后药渣的5种方法提取液对兔离体肠平滑肌均具有抑制作用，其中sbe液的作用最强，这与其5种方法提取液的成分指标比较结果相吻合。
   
　　本实验中将香附经sfe-co2后药渣的5种方法提取液浓缩后，离心，除去药液中大颗粒物质，调至ph7.0，并置水浴中保温(37℃)，以减少药液的颗粒物、ph、温度对组织细胞的直接刺激影响。

【参考文献】
  1］国家药典委员会．中国药典，ⅰ部［s］．北京：化学工业出版社，2005：181.

　　［2］黄险峰，彭国平. 香附的化学成分及药理研究进展［j］.中药材,2003，26(1):65.

　　［3］王明江，冯桂香，熊顺华. 香附水提剂对离体兔肠管活动的影响［j］. 郧阳医学院学报，1999，18(4):194.

　　［4］齐汝霞，王清，张鹏，等. 棕榈花蕾水提取液对兔离体肠平滑肌作用的影响［j］.中国民族民间医药杂志，2006，2:115.

　　［5］阮孟选，荣向路，吴清和. 桂枝汤拆方对离体兔肠张力的影响［j］.中国科技信息，2007，4:194.