作者：郭秀莲，张正银，田萍，罗绍银，白洁，庄平

【摘要】  目的研究杜鹃花叶片总rna的提取方法。方法一种适合富含次生代谢产物的杜鹃花叶片总rna的提取方法——改良ctab法。采用ctab作为去污剂，分别用氯仿和水饱和酚反复抽提以及高浓度nacl沉淀，以去除蛋白质、多糖和次生代谢物等杂质，最后用无水乙醇沉淀获得总rna。结果该方法不仅使所获得的总rna完整性好，纯度高，而且操作简单、快速、成本低廉。结论该方法对杜鹃花等富含次生代谢产物的植物特别是富含多酚、多糖的材料的总rna提取具有借鉴意义。

【关键词】  rna提取； 杜鹃花； 改良ctab法

    chinaabstract：objectiveto study the method for isolation of total rna from rhododendron leaf. methodsan improved ctab method was presented here to be suitable for isolation of total rna from rhododendron leaf , a plant which contained abundant secondary metabolites. using chemical ctab as detergent in the extraction buffer, the absolute ethanol precipitation of rna was performed finally after removing of proteins, polysaccharides, and secondary metabolites by subsequent chloroform, h2o-saturated phenol extraction and high concentration nacl precipitation, respectively.resultsthe yielded total rna had integrality and high purity but. conclusion the method may be applied to some difficult rna extraction plants full of polyphenol and polysaccharides, particularly rhododendron.

　　key words： rna extraction;   rhododendron;   improved ctab method
   
　　杜鹃花叶片中的蛋白质、多糖、多酚等次生物质含量多且复杂，严重影响了其rna的提取质量，从而给此类植物的基因工程研究带来了诸多阻碍。www.11665.COm由于多糖类胶状物质会严重堵塞过滤柱，所以即使使用商业提取试剂盒也不能得到高质量的rna；另外，这类次生代谢物含量多的材料，市售的rna提取试剂的针对性也不强，不仅操作麻烦费时，而且很难同时解决rna的质量和得率问题。虽然目前已建立了很多针对富含多糖多酚材料的rna提取方法［1～5］，但还没有以杜鹃花为材料提取rna的报道。因此，本实验以杜鹃花叶片为材料，借鉴ctab法［6］并进行了改良，提出一套适合提取杜鹃花叶片总rna方法。

　　1  材料与仪器

　　1.1  试剂与仪器提取液配方：2%ctab(w/v)，4%pvp(w/v)，100mmol·l-1tris-hcl(ph8.0)，25 mmol·l-1edta(ph 8.0)，5 mol·l-1nacl，混匀灭菌121℃，15 min，灭菌后加入体积分数2%的2-硫基乙醇。 depc购自amresco公司；琼脂糖购自sigma 公司；rtaq酶，dntps购自takara（大连）有限公司；引物由invitrogen公司合成。其他试剂均为国产分析纯。
   
　　冷冻离心机：centrifuge 5804 r(eppendorf 公司)；电泳仪：dyy-ⅲ 1型稳压仪(北京六一仪器厂)；紫外凝胶成像系统：bio imaging system(syngene)；紫外可见分光光度计：tu-1800(北京普析通用仪器有限责任公司)；pcr 仪：personalcycler (biometra 公司)。

　　1.2  材料多年生杜鹃花叶片采自龙池华西亚高山杜鹃园，采下后立即用液氮浇淋，于-70 ℃贮存备用。

　　2  方法

　　2.1  几种试剂盒法提取杜鹃花叶片总rnarna plant试剂提取法：试剂购自tiangen公司，实验操作按照说明书进行；tri reagent 试剂提取法：试剂购自ambion公司，实验操作按照说明书进行；rneasy plant mini kit试剂提取法：试剂购自qiagen公司，试验操作按照说明书进行。

　　2.2  改良ctab法提取程序：①称取100 mg的杜鹃花叶片，迅速放入液氮研磨至粉末状，转入1.5 ml离心管内，加入65℃预热的0.75ml提取液，涡旋振荡混匀后65℃温浴20 min。②加入与提取液等体积的水饱和酚，振荡摇匀，4 ℃ 12 000 r·min-1离心10min。③上清转入新的无rnase离心管；加入与提取液等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)混匀，4℃，12 000 r·min-1离心10 min。④吸上清装入新的离心管里，加入1/2上清体积5 mol·l-1 nacl，摇晃混匀，再加入1/2体积氯仿，振荡混匀，4 ℃，12 000 r·min-1离心10 min。⑤上清液转入新的无rnase离心管并加入等体积的异丙醇，温和混匀后室温放置10 min，4 ℃ 12 000 r·min-1离心10 min，小心倒掉上清液；加入1 ml 70%乙醇，4 ℃ 12 000 r·min-1离心1 min，小心倒掉上清液；加入30～50 μl depc处理水溶解沉淀。⑥加入dnase i(10 u·μl-1)1 μl混匀，37℃温浴30 min。⑦加入100 μl depc处理水稀释后，再加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次 ，4℃，12 000 r·min-1离心10 min。⑧吸上清液，加入1 ml无水乙醇， -20℃静置2 h。⑨4℃，12 000 r·min-1离心5 min弃上清液，用70%的乙醇洗涤。⑩4℃，12 000 r·min-1离心10 min弃上清，干燥后加入20μl depc处理水保存备用。

　　2.3  rna完整性与质量检测使用各种方法提取时，样品的起始量均为100 mg，得到的rna样品都稀释10倍后取1 μl进行非变性琼脂糖凝胶电泳，在紫外凝胶成像系统中观察提取的rna完整性。取1 μl样品，稀释50倍，紫外分光光度计测量其在230 nm，260 nm，280 nm处的紫外吸光值(a)。计算a260 nm/a280 nm，a260 nm/a230 nm用于纯度分析。

　　2.4  rt-pcr按takara公司amv反转录酶操作手册进行。合成一对克隆18s rrna序列的引物18s a(5'-caaccataaacgatgccgacc-3')和18s b (5'-cagccttgcgaccat actccc-3')，以反转录产物为模板进行pcr扩增。扩增条件为94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s→63 ℃ 40 s→72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃ 7 min。1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定pcr产物。

　　2.5  杜鹃花 hsp70基因cdna 核心片段的克隆根据已知植物hsp70基因核甘酸序列（mrna）的保守区域设计合成下述4个正向或反向简并引物做巢式pcr。外测为c1: 5'-ggnathgayytnggnacn- 3'，c2: 5'- nccngcrtc yttngtngc -3'；内测为d1: 5'-gaycarggnaaymgnacnacncc-3'，d2: 5'-rtcrtt raartangcnggnac-3'。预期pcr产物片段大小为350 bp左右。以上述cdna为模板，用taq dna聚合酶进行巢式pcr扩增，以引物c1，c2进行巢式pcr的首轮扩增，反应体系为cdna 1 μl 、10×pcr 缓冲液(无mg2+)2 μl 、dntp (2.5 mmol· l-1) 2.4 μl 、rtaq 酶0.25 μl (2 u·l-1)，以及c1、c2(100 mol·l-1)各1 μl，mg2+（25 mmol· l-1）2.4 μl，加ddh2o 至20 μl。扩增条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 50 s，49 ℃ 50 s ，72 ℃ 1 min ，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min。 取首次扩增产物1 μl，稀释20 倍作为第2轮扩增的模板，用引物d1、d2进行巢式pcr的第二轮扩增，反应体系与巢式pcr的首轮扩增相同,扩增条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 50 s，50 ℃ 50 s ，72 ℃1 min，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min。

　　3  结果

　　3.1  rna完整性分析通过琼脂糖凝胶电泳可以直观地看到（见图1），改良ctab法提取的杜鹃花叶片总rna，条带清晰，完整，不拖尾(泳道1，2)，说明在该方法中rna很少降解。而rnaplant试剂提取的rna (泳道3，4)，在初始加入材料量相同的情况下，条带较暗也就是得率较低。而tri reagent 试剂盒和rneasy plant mini kit 试剂盒均未能提取得到杜鹃花叶片总rna。

　　3.2  rna 完整性分析及质量检测用紫外分光光度计测量改良ctab法得到的rna样品的a260 nm、a280 nm和a230 nm值。经过多次实验的结果计算， a260/ a280平均约为2.02，a260/a230平均约为1.97。a260/a280和a260/a230比值均在许可范围内。在rna得率方面，用100 mg鲜重的起始材料，可得到20 μg左右的总rna。

　　3.3  pcr验证以改良ctab法提取的rna进行反转录产物为模板，用18s a，18s b为引物进行pcr。实验结果表明，能成功地扩增出长度为110 bp左右的目的片段。这进一步说明本实验法提取的rna样品完整，可以用于后续试验(见图2)。

　　3.4  杜鹃花 hsp70基因cdna 核心片段的扩增采用简并引物c1和c2进行巢式pcr第1轮扩增仅得到模糊的条带，进一步采用内侧锚定简并引物d1和d2进行巢式pcr的第2轮扩增到1条约350 bp的dna片段，与预计的目的片段相似（见图3）。回收后克隆至pmd18-t载体(takara)，转化感受态dh5α，利用d1、d2引物，将通过菌落pcr反应检测得到阳性克隆进行测序，得到366bp的cdna片段。测序后通过ncbi上的blast工具分析，证实为hsp70基因序列。

　　4  讨论

    能否有效抑制rnase，去除多糖、酚叶片中含有大量的多酚，多糖，对rna的提取方法提出了更高的要求。本实验采用ctab(十六烷基溴化三甲胺)裂解植物材料，与细胞中的核酸形成核酸-ctab复合体，这类复合物沉淀的时候将蛋白、多糖、色素以及多酚类化合物与核酸分离开来。利用水饱和酚可以部分去除dna，获得dna残留极少的rna，减少dna污染；同时，由于水饱和酚的加入，提高了去除蛋白质的效率，使得氯仿抽提次数在提取过程中减少，本实验中只需再进行一次氯仿：异戊醇抽提，就能使有机相与水相的界面清亮，彻底去除蛋白，避免了反复操作。
   
　　近年来已有关于去除植物组织多糖和酚类物质的相关报道，但不同植物或同一植物的不同品种往往因种属差异，材料组织内多糖或多酚的组分和含量有很大不同，所以需要采用不同的rna提取方法。有研究表明，在高浓度na+或k+的存在条件下，通过氯仿抽提可以去除一些多糖，经过本实验确定，与高浓度的kac相比，高浓度的nacl去除样品中多糖的效果更好，从而建立了有效提取样品rna的方案。与传统ctab法相比，本实验减少了用licl选择性沉淀rna过夜的步骤，改为分级去除杂质，节省了试验时间，有利于减少rna的降解和损耗，提高了样品的质量。
   
　　rna plant试剂对于杜鹃花这种多酚，多糖含量都很高的材料，效果一般，可能多糖形成难溶的胶状物，与rna共沉淀下来［7］。本实验所用的药品、试剂都较为常用，采用该方法能在一天内完成rna的提取工作，并得到质量很高的产品，相比购买市售的rna提取试剂盒或传统ctab法，具有花费少、易操作、耗时短、成效高的优点。

【参考文献】
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　　［4］a. da silva gesteira, f. micheli, c. fortes ferreira. isolation and purifcation of functional total rna from diverse organs of cacao tree during its interaction with the pathogen crinipillis perniciosa［j］. biotechniques,2003, 35: 495.

　　［5］jackola l, pirttila a.m, halonen m,et al. isolation of high quality rna from bilberry (vaccinium myrtillus l)fruit［j］.mol biotechnology,2001,19:201.

　　［6］刘志，杨永华.ctab法提取中草药材滇紫草细胞的总rna［j］.生物技术通讯, 2004, 4: 372.

　　［7］myeong-hyeon w,hak-ik r. improved technique for isolating rna from tobacco tissues［j］. plant molecular biology reporter,2001,19:187