【摘要】 目的优选出地黄中梓醇的最佳提取工艺。方法以梓醇含量为指标，利用 l9（34）正交实验法，以乙醇浓度、提取次数、加醇倍数、提取时间为因素，每个因素取3个水平，进行实验，来确定最佳制备工艺。结果最佳工艺为12倍量95%乙醇提取2次，1 h/次。结论经优化后工艺条件可靠，适合地黄中梓醇的提取工艺的参考。
【关键词】 地黄； 梓醇； 正交实验
optimization of the extraction technology of catalpol from rehmannia glutinosa libosch by orthogonal design
liu ying, yang jing ,huang lei, xu yan, yue chunli,wei zhongmin*
（the key laboratory of molecular biology and new drug r&d, liaoning medical university, jinzhou 121001, china; jinzhou institute of drug control, jinzhou 121001, china; dalian merro pharmaceutical co., ltd., dalian 116000, china）
abstract：objectiveto explore an optimum extraction technology of catalpol from rehmannia glutinosa libosch. methodsusing catalpol as the index, the effects of alcohol concentration, extraction time, solvent amount and extraction degree on extraction technology were evaluated by orthogonal design.resultsthe superior technology of catalpol was as follows: 95% alcohol, 1 hour, 12 fold solvent and extracted 2 times.conclusionthe optimum extraction process is stable and accurate, and it is suitable for extraction of catalpol from rehmannia glutinosa libosch.
key words：rehmannia glutinosa libosch； catalpol； orthogonal design
生地黄为玄参科植物地黄rehmannia glutinosa libosch的干燥块根，系常用的补药，临床应用十分广泛。WWw.11665.CoM传统医学认为地黄具有滋阴补血、生津的功效。生地黄的主要活性部分是环烯醚萜苷类，而环烯醚萜苷类中含量最高的是梓醇。现代研究证明梓醇具有降血糖［1］，预防治疗哮喘病，治疗乙型肝炎病毒感染，对缺血再灌注受损神经元有保护作用［2］，抗癌［3］等药理作用。目前梓醇的开发是一个热点，但由于梓醇化学性质不稳定，易受酸碱［4］等条件影响，这为梓醇的提取增加了难度，本实验对回流提取、超声提取、40℃温浸3种提取方式及甲醇、乙醇和水的提取溶媒进行了筛选，在此基础上，利用正交实验，以梓醇含量和干浸膏的重量为指标优选出最佳工艺。
1 仪器与试药
lc-10vp高效液相色谱仪，日本岛津公司生产；kq-250b型超声波清洗器，昆山市超声波仪器公司生产；a240型电子天平，美国梅特勒公司生产；恒温水浴箱 ，北京市永光医疗仪器厂。生地黄，产自河南省武涉县西陶镇，由锦州奥鸿药业有限责任公司质量部照2005年版《中国药典》ⅰ部地黄质量标准检验，符合规定。梓醇对照品，批号110808-200407，购于中国药品生物制品检定所；乙腈，美国fish公司生产；其余试剂为国产分析纯。
2 方法
2.1 梓醇的含量测定
2.1.1 色谱条件 色谱柱：日本岛津 vp-ods柱，4.6 mm ×150 mm；流动相为乙腈∶0.1%磷酸（1∶99）；流速：0.9 ml·min-1；柱温：36℃ ；检测波长：214 nm。
2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的梓醇对照品5.0 mg，置1ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液备用。
2.1.3 供试品溶液的制备 取地黄样品适量，粉碎，过2号筛，精密称定100 g,加入95%乙醇1 000 ml，回流提取2 h，滤过，将滤液减压浓缩至干加100 ml水溶解，用0.45 μm滤膜滤过，取续滤液即得。
2.1.4 梓醇标准曲线绘制 分别精密称取梓醇对照品加水配制浓度分别为3.0，4.0，5.0，6.0，7.0 mg·ml-1，按色谱条件，分别进样10 μl对照品溶液，测得峰面积，以对照品重量为横坐标，以峰面积为纵坐标，得线性回归方程为：y=806 095x+106，r=0.999 6。结果表明梓醇在3.0～7.0 mg·ml-1时进样量与峰面积呈良好线性关系。
2.1.5 精密度实验取同一对照品溶液，按上述色谱条件，重复进样6次，每次10 μl，测定梓醇峰面积，其rsd为0.66％，表明该法的精密度良好。
2.1.6 稳定性实验取同一供试品溶液，分别于0，3，6，9，12，24 h，按上述色谱条件，进样10 μl，测定梓醇峰面积，rsd为0.44% ，表明梓醇在24 h内稳定。
2.1.7 重复性实验取同一批地黄样品6份，按“2.1.3”项下方法制样后，以上述色谱条件，进样，测定梓醇的峰面积，按外标法计算含量，rsd为2.7%，表明分析方法重复性良好。
2.1.8 加样回收率实验精密称取已知含量的生地黄提取液10 ml，分别定量加入梓醇对照品，计算回收率(见表1)。平均回收率为99.3%，rsd为1.39%。
结果表明本方法具有良好的回收率。以上实验表明该方法测定梓醇准确可靠。
2.2 提取工艺的优化
2.2.1 优选实验方法和溶剂 文献报道梓醇的提取方法有回流提取、超声提取、冷浸法等，本实验分别考察3种方法和3种溶剂在提取过程中对梓醇提取率的影响。
表1 回收率实验结果（略）
实验方法：取生地黄样品粉碎，过2号筛，称取9份样品，每份10g，将9份样品分成3组，每组分别加入100 ml水、100 ml95%乙醇、100 ml甲醇，将第1组分别超声提取70 hz，20 min，第2组回流提取2 h，第3组40℃温浸6 h，分别过滤取滤液减压浓缩至干，分别加入10 ml水溶解，滤过，取滤液液相检测梓醇含量，并计算干浸膏的重量。结果见表2。
表2 不同提取方法不同溶剂提取后测得干浸膏重量和梓醇含量（略）
由表2可见回流提取方法优于其他两种方法，在溶剂方面虽然甲醇的提取率高，但是干浸膏重量大，即杂质含量高，对下一步的纯化带来一定的难度，并且甲醇毒性大，所以最佳的提取方法为乙醇回流提取。
2.2.2 正交实验设计 由上述实验选择乙醇回流提取，且对乙醇浓度（a）、乙醇倍数(b)、提取次数(c) 、提取时间(d)4个因素进行考察，每个因素设计3个水平，设计l9（34）正交实验。因素水平表见表3。
表3 因素水平（略）
2.2.3 实验方法及结果 称取粉碎后的生地黄药材9份，每份100 g，按表4的设计进行回流提取，每次提取1 h，合并滤液，放凉后滤过，减压浓缩至干，称量干浸膏的重量，向干膏中加100 ml水溶解，用0.45 μm滤膜滤过，取滤液按梓醇含量测定项下测定。
2.2.4 正交实验结果分析 结果见表5。直观分析表明，干浸膏得率极差大小为a>c>b>d，较好工艺组合为a3b2c1d3。梓醇含量极差大小为a>c>b>d，较好工艺组合为a3b3c2d1。方差分析的结果表明，因素a对整个实验验结果影响最大，以后依次为c、b、d。因素a对试验结果具有显著意义，a3提取效果最好，提取率高，宜选择a3；因素b、c、d对干浸膏重量和梓醇含量无显著性影响。故从干浸膏重量最小梓醇含量高两方面考虑，确定生地黄提取工艺条件为a3b3c2d1，即12倍量95%乙醇提取两次，1 h/次。
2.2.5 验证实验 根据上述结果筛选的工艺重新进行实验，进一步验证前面工艺的正确性。提取率在80%以上。
表4 正交实验设计及实验结果（略）
表5 方差分析（略）
3 讨论
通过对超声提取、室温浸出提取、回流提取3个提取方法的考察得出了回流提取梓醇含量高。在溶剂选择方面分别对水、甲醇、95%乙醇3种溶剂进行了考察，在干浸膏重量上95%乙醇低于其他两个溶剂，分析可能由于大量的糖类、氨基酸等水溶性杂质不能被乙醇提出来的缘故［5］。这样对后期梓醇的纯化带来很大的方便。在此基础上我们采用了正交实验对不同的乙醇浓度、提取时间、提取次数、提取溶剂倍数。分别选择了3个水平分别进行考察。得出了乙醇浓度对干浸膏和梓醇含量影响较显著。有文献对地黄中梓醇变化的条件进行研究，结果表明，梓醇溶于水中加热100℃10 h后，其含量未见明显变化；但在酸、碱条件下极不稳定。因此实验所确定回流提取工艺对梓醇含量不会有影响，而且较适合工业生产，对梓醇提取的工业化提供了一定的技术参数。
【参考文献】
［1］ 万昌武,张雅丽,桂华珍,等.地黄不同方法提取物制剂降糖作用的实验研究［j］.贵州医药,2003,27(12):1112.
［2］ 李 杨,李丹清,包永明,等.梓醇对缺血再灌注受损伤神经元保护作用的研究［j］ .中国现代医学杂志，2005, 15（10）:1454.
［3］ pungitore c r, ayubm j, borkowski e j, et al.inhibition of taq dna polymerase by catalpol［j］. cell mol biol,2004,50(6):767.
［4］ 王宏洁,边宝林,杨 健. 地黄中梓醇变化条件的探讨［j］. 中国中药杂志, 1997, 22 (7) : 408.
［5］ 张 玲,徐新刚.地黄提取工艺研究［j］. 中草药, 1998, 29 (5):308.
