作者：贺红燕，刘晓伟，肖卫平，张真瑞，彭树灵
【摘要】 目的观察维胃方对血清白介素-2(il-2)的影响，探讨其治疗胃溃疡的可能机制。方法采用冰醋酸烧灼法制备大鼠胃溃疡模型。经维胃方治疗后测量胃液ph值、计算溃疡面积、观察溃疡周围病理组织切片，并采用放射性免疫法检测血清il-2水平。结果从胃黏膜大体观察及病理切片观察，用药组大鼠胃黏膜溃疡愈合良好;与模型组比较，维胃方能恢复胃液 ph值(p<0.01);用药组大鼠胃黏膜溃疡面积明显小于自愈组(p<0.01)，其中维胃方中剂量组疗效最好〔(2.19±0.26)mm2〕;与自愈组相比较，维胃方各组可升高血清il-2水平(p<0.05)，维胃方中剂量组〔(0.770±0.038)ng/ml〕与雷尼替丁组存在着显著性差异(p<0.05)。结论维胃方对实验性胃溃疡具有明显的愈合作用，其作用机制可能与其改善机体细胞免疫功能，调节血清中 il-2的水平有关。
【关键词】 维胃方; 胃溃疡; 白介素2
abstract：objectiveto observe the effect of wwf on serum il-2 in experimental rats with gastric ulcer and possible mechanisms. methodsthe model rats with gastric ulcer were prepared by glacial acetic acid. after treating them with wwf, we measured gastric juice ph values, calculated gastric mucosa ulcer areas, observed pathological tissue around ulcer, and detected the level of serum il-2 by radioactive immunoassay. resultsfrom general and pathological observation on gastric mucosa,it showed that mucosa of rats in drug groups was in good condition. compared with model group, wwf could recover the values of ph; gastric ulcer areas in drug groups was significantly smaller than that of self-healing group (p <0.01), and the effect of wwf group middle-dose was the best〔(2.19±0.26)mm2〕. compared with self-healing group, wwf could elevate serum level of il-2(p<0.05),and there was a significant difference between middle-dose wwf group 〔(0.770±0.038)ng/ml〕and ranitidine group (p<0.05). conclusionthere is obvious therapeutic effect of wwf on experimental gastric ulcer, and the possible mechanism is related to improving cellular immune function and adjusting level of serum il-2.
key words：weiweifang prescription; gastric ulcer; il-2
胃溃疡是临床常见病、多发病，制酸及抗hp使溃疡的治愈率大为提高，但溃疡的复发问题仍没有得到根本解决。WWW.11665.com寻求有效的药物治疗以提高溃疡愈合质量，成为当今医药界研究的热点之一。中医中药在改善全身状况等方面具有自身的优越性，因而受到广泛关注。维胃方是导师刘晓伟教授治疗胃溃疡的经验方，临床上有确切的疗效。il-2是目前被证实具有显著的免疫增强作用的一种细胞因子。本研究通过对大鼠胃液ph值、溃疡面积、病理组织切片及血清il-2水平的观察，探讨维胃方治疗胃溃疡的作用机制，为中医药的临床运用和开发提供实验依据。
1 材料与仪器
1.1 动物 spf级雄性 wistar大鼠 56只，体重220～260 g，购于南方医科大学实验动物中心。动物合格证号：scxk粤2006-0015号，质量检测单位：广东省实验动物监测所。室温22～26℃安静环境下饲养,喂以固定的平衡饲料。
1.2 药物 维胃方由茯苓、蒲公英、白及、三七组成，药材购于南方医科大学附属南方医院中药房，经南方医科大学中医药学院药用植物与鉴定教研室鉴定。按人和大鼠体表面积系数换算方法，大鼠等用剂量=(人用剂量×0.018×5) g/ kg。维胃方药物组分低、中、高3个剂量，常规煎煮取汁、浓缩、高压灭菌。其中大鼠生药含量0.75 g/ml为中剂量，低剂量和高剂量分别为0.375 g/ml和1.5 g/ml。雷尼替丁胶囊按0.003 g/ml浓度配置成混悬液。以上药物均保存于4℃冰箱中。
1.3 试剂 100%冰醋酸(广东省光华化学厂有限公司，批号20070903);水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司，批号20060220);雷尼替丁胶囊(广东佛山阿特维斯制药有限公司，批号0802763);il-2放免试剂盒(北京普尔伟业生物科技有限公司提供，批号 20081024)。
1.4 仪器低速离心机 ld5-2a型(北京医用离心机厂); leicarm2135切片机(德国 leic公司);光学显微镜(olympus公司);sn-695b型放免测量仪(上海日环仪器一厂)。
2 方法
2.1 分组及给药 按完全随机法分为7组，每组8只。正常组：自由饮水，进食;模型组、自愈组：冰醋酸致大鼠胃溃疡术后，自由饮水进食;维胃方低、中、高剂量组、雷尼替丁组：冰醋酸致大鼠胃溃疡术后第4天开始，分别灌胃低、中、高剂量维胃方药液、雷尼替丁混悬液，1次/d，连续7 d。造模各组术后次日起给予自由饮食。模型组在造模后第4天取材，其它各组均在造模后第11天取材。
2.2 造模参照takagi等[1]的经典造模方法，并加以改进。大鼠造模前24 h 禁食不禁水。按3.5 ml/kg体重腹腔内注射10%水合氯醛麻醉。仰卧位四肢固定，腹部剃毛、消毒，铺手术孔巾，于剑突下腹中线纵向打开腹腔，手术切口长约2 cm，将胃轻轻移出腹腔，在胃前壁浆膜面窦体交界处靠胃窦侧用100%冰醋酸浸泡过的直径为5 mm的圆形滤纸压贴30 s×2次，用生理盐水棉签轻轻抹洗2 次，然后将胃还纳腹腔，分层缝合腹壁肌肉和皮肤，75%酒精棉球消毒切口及周围。
2.3 指标检测
2.3.1 血清il-2含量测定 腹主动脉采血约3ml于普通负压采血管中，4℃冰箱中静置待自然凝固收缩后, 以2 000 r/min离心10min，分离血清保存于-20℃冰箱。采用放射免疫法测定血清il-2含量，操作按照说明书进行。
2.3.2 测量胃液ph值 在剑突下偏左剪开腹腔，暴露胃部。结扎贲门，于十二指肠和食管处剪断取出鼠胃，由幽门挤出少量胃液于ph试纸上，读取并记录ph值。
2.3.3 溃疡面积 由幽门处向胃内注入10%中性福尔马林溶液10 ml，固定10 min后沿胃大弯剪开，展平，用游标卡尺测量溃疡面的最大横径及最大纵径，分别记为d1、d2。溃疡面积(s)按公式s=π×d1×d2×1/4计算(π取3.14)。
2.3.4 胃黏膜病理组织切片制备 以溃疡瘢痕平行于胃长轴方向的最长径为中心取材，放入10%中性福尔马林溶液中固定，常规脱水、包蜡、切片、he染色后于光学显微镜下观察。
2.4 统计学处理 实验数据用(±s)表示。多个样本均数比较用单因素方差分析(one-way anova)，组间均数两两比较若方差齐性，用lsd法;若方差不齐性，用dunnett's t3方法。以上数据均用spss13.0统计软件进行分析。显著性水平p<0.05。
3 结果
3.1 肉眼观察标本正常组：胃黏膜光整完好，呈淡红色，无充血、水肿、糜烂等。模型组：浆膜面造模处有黄色炎性分泌物与周围组织粘连，胃窦处见火山口样溃疡，底部覆盖有黄白苔，部分标本有多个溃疡点或溃面。自愈组：浆膜面充血，与周围有粘连，胃窦区黏膜溃疡愈合不全，可见苍白色瘢痕组织增生。雷尼替丁组：浆膜面少有粘连，胃窦区黏膜溃疡多数基本愈合，表面粗糙色白。维胃方低、高剂量组：部分可见浆膜面粘连，胃窦黏膜可见少数溃疡点或瘢痕组织增生;维胃方中剂量组：浆膜面少粘连，胃黏膜表面多数已愈合，极少溃疡点或仅见小范围瘢痕增生。
3.2 镜下观察病理切片 正常组：黏膜层完整，腺细胞排列均匀，黏膜下层、肌层、浆膜层完好。模型组：溃疡处粘膜缺损大，腺体完全被破坏;黏膜下层毛细血管内见血流淤滞，部分毛细血管破裂、出血，粘膜下层、浆膜层见大量炎性细胞浸润。自愈组：部分黏膜缺损达黏膜肌层，再生腺细胞排列紊乱;黏膜下层有炎细胞浸润，见明显血栓。雷尼替丁组：缺损较小，表面见新生上皮细胞及腺细胞，排列致密不整齐;黏膜下层有炎细胞浸润，肌层见瘢痕纤维形成。维胃方各剂量组：维胃方组低、高剂量组可见缺损达腺细胞层，再生腺细胞密度不匀，黏膜下层炎细胞浸润，其中高剂量组腺体细胞增生数量较多，黏膜下血管未见明显病理改变，但仍有炎性细胞浸润;中剂量组黏膜基本完整，腺体细胞增生数量较多;黏膜下层仅见少量炎性细胞浸润。
3.3 胃液ph值 模型组和自愈组ph值明显高于正常组(p<0.05)。维胃方可以促进腺体再生，恢复泌酸功能，其中以低、中剂量组较接近正常组水平, 结果见表1。
3.4 血清il-2含量的比较 各用药组与自愈组的差异有统计学意义(p<0.05);维胃方中、高剂量组的il-2水平较高与正常组无显著性差异(p>0.05);维胃方中剂量与雷尼替丁组的差异有统计学意义(p<0.05)结果见表1。
3.5 溃疡面积 各用药组与自愈组溃疡面积的差异均有统计学意义;维胃方中剂量组与雷尼替丁组存在显著性差异(p<0.01)，表明维胃方中剂量治疗效果优于雷尼替丁，结果见表2。表1 各组胃液ph值及血清il-2含量变化分析与模型组比较，△p<0.05，△△p<0.01;与正常组比较，*p<0.05，**p<0.01;与自愈组比较，#p<0.05、##p<0.01;与雷尼替丁比较，▽p<0.05;n=8表2 溃疡面积的比较与自愈组比较，δp<0.05，δδp<0.01;与雷尼替丁组比较，#p<0.05，##p<0.01;n=8
4 讨论
胃溃疡属于祖国医学中的“胃痛”“吞酸”等范畴。初起多由外感寒邪、饮食所伤、情志不遂等引发，病变较单一，日久多种病因相互作用相互影响，由实转虚或虚实错杂，迁延不愈。临床上胃溃疡以虚实夹杂、寒热并见、气滞血瘀者较为多见。维胃方由茯苓、蒲公英、白及、三七4味药组成。白及能收敛止血，消肿生肌，《本草纲目》中指出“以此研末日服，能坚敛脏，封填破损，痈肿可消，溃败可托，死肌可去，脓血可洁，有托早生新之妙用也”。三七可活血化瘀，消肿止痛，茯苓可补益脾胃，蒲公英清热解毒、消痈散结，《本草正义》中指出：“蒲公英，其性清凉，治一切疔疮、痈疡、红肿热毒诸证，可服可敷，颇有应验”。全方配伍能标本兼顾，寒热并用，既顾护脾胃，又能消肿生肌、化瘀解毒、活血止痛，该方在临床上加减化裁，疗效显著。维胃方已从一氧化氮(no)、胃泌素(gas)、表皮生长因子(egf)、神经降压素(nt)、氨基己糖等指标进行了研究，研究表明维胃方可减少no生成，减轻no对胃黏膜损伤[2];减少黏膜攻击和增强胃黏膜保护[3];提高大鼠胃壁粘液的分泌量[4];通过nt对机体起着整体性调节作用[5];能改善溃疡愈合的条件，促进胃黏膜的修复[6]。
本研究中，模型组ph值明显高于正常组，原因可能为造模后大鼠胃黏膜受损伤，腺体被破坏，泌酸功能随之降低;经各用药组治疗后，溃疡基本愈合，受损胃黏膜被修复，促进腺体增生，泌酸功能逐渐恢复。同时，维胃方各组的溃疡面积均小于自愈组，其中以维胃方中剂量组效果最好。胃黏膜肉眼大体观察及病理组织镜下观察结果亦与上述结论相符。
机体维持正常的免疫功能状态赖于各种免疫细胞(特别是t 细胞亚群) 之间相互协作和相互制约，以产生适度的免疫应答,使之既能清除异物抗原，又不损伤机体组织。当机体的调控网络失去平衡时可引起免疫紊乱，补体水平低下，不能有效清除免疫复合物(immune complex，ic)，形成ic 沉积，干扰相应器官的正常生理功能，促进炎性递质如il-6、il-8、肿瘤坏死因子α( tnf-α)、血小板活化因子( paf) 等的释放，造成胃黏膜组织损伤，从而引起胃溃疡[7]。
il-2是由辅助性 t淋巴细胞在抗原或有丝分裂原刺激和il-1诱导下合成分泌的重要细胞免疫因子，它不仅可以促进t 细胞增殖和分化，促进b细胞增殖和分泌抗体，增强nk的杀伤活性，激活巨噬细胞，还能促进多种淋巴因子,如干扰素、肿瘤坏死因子等的合成与释放以及抗体生成，共同发挥免疫功能，因而il-2 在机体免疫应答、免疫调节、抗损伤等方面具有重要的作用。其产生和表达异常，可对机体的免疫调节机能、疾病、损伤等具有提示作用[8]。il-2 水平高低可作为机体细胞免疫功能的重要指标。本实验中，模型组il-2水平较低，与正常组相比较其差异有统计学意义(p<0.01),提示胃溃疡大鼠t细胞的增殖分化受抑制，活性降低、数量减少、功能低下，导致il-2 水平低下，反映了宿主细胞免疫功能下降，免疫系统清除自身衰老变性细胞、自体变性和损伤细胞方面能力降低，不能有效清除致病因子，致溃疡产生或难愈;自愈组水平与模型组亦有差异(p<0.05)，说明在溃疡形成后，机体可调动自身的免疫调节机制，提高细胞的免疫功能，但是这种调节能力有限，不能有效地改善溃疡愈合情况。维胃方各组大鼠血清il-2与自愈组有显著性差异，结果提示维胃方能通过升高il-2 水平，促进t淋巴细胞增殖分化，改善机体的细胞免疫功能，有效地杀灭致病因子，从而防止溃疡发展，促进溃疡愈合。与雷尼替丁相比较，维胃方中剂量组改善细胞免疫功能的能力更有优势，可能与雷尼替丁作用机制主要表现为能抑制胃酸分泌，降低胃蛋白酶的活性有关。
综合胃黏膜标本的大体观察、病理组织切片及溃疡面积来看，说明维胃方对胃溃疡有较好的治疗效果，其中以维胃方中剂量最佳。推测其促进溃疡愈合的可能机制与提高机体的细胞免疫功能，升高血清il-2水平有关，其相关机制还有待进一步研究证实。
【参考文献】
[1] takik，okabes, sazikir. a new method for the production of chronic gastric ulcer in rats and the effect of several drugs on its healing[j].jpn j phartmacol, 1969, 19: 418.
[2] 丁慧波，刘晓伟，陈 欣，等. 维胃方对实验性大鼠胃溃疡血清no和nos的影响[j].四川中医，2007，26(9):17.
[3] 苏尚贤，刘晓伟，张晓洁，等. 维胃方对实验性大鼠胃溃疡治疗机理的研究[j].深圳中西医结合杂志，2007，17(4):203.
[4] 肖卫平，刘晓伟，卓冰帆，等. 维胃方对胃溃疡大鼠胃粘膜氨基己糖含量的影响[j].浙江中医杂志，2008，53(7):379.
[5] 陈窕圆，刘晓伟，丁慧波，等. 维胃方对乙酸致大鼠胃溃疡的治疗作用及与血浆神经降压素相关性研究[j]. 中国中西医结合消化杂志，2007，15(3):147.
[6] 陈 欣，刘晓伟，陈窕圆，等. 维胃方对乙酸诱导大鼠胃溃疡愈合效果及血清gas,egf水平的影响[j].时珍国医国药，2007，18:2335.
[7] 宋春辉，李 桂，孟润岭，等. 胃康胶囊对胃溃疡患者t细胞亚群及白细胞介素2和6水平的影响[j]. 中国中西医结合消化杂志，2007，15(3):158.
[8] brian k. mcfarlin,michael g , ted hampton. flynn. carbohydrate consumption during cycling increases in vitro nk cell responses to il-2 and ifn-γ[j]. brain,behavior,and immunity,2007,21(2):207.
