作者：姜泽群，徐继敏，吴琼，何光源

【摘要】  目的 研究黑芝麻的水提取物对b16黑素瘤细胞系酪氨酸酶活性、黑素合成及相关基因和蛋白表达的影响，探讨黑芝麻促进黑色素合成的可能机制。方法选择3种浓度(0.5,1,2 mg/ml)的黑芝麻水提物作用于b16黑素瘤细胞72 h，观察其对黑素细胞的增殖、酪氨酸酶活性和黑素含量的影响。免疫印迹法和半定量逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)分别检测药物作用48 h前后酪氨酸酶(tyrosinase)、小眼相关转录因子(microphthalmia associated transcription factor，mitf)，酪氨酸酶相关蛋白酶1(trpl)和酪氨酸酶相关蛋白酶2(trp2)蛋白和mrna表达水平的变化。结果3种浓度的黑芝麻水提物可轻微促进b16细胞的增殖(p> 0.05);试验浓度范围内可明显促进b16细胞黑素合成和酪氨酸酶活性增加( p< 0.05)，并以浓度依赖方式促进酪氨酸酶和mitf的蛋白和mrna表达( p< 0.05)，但对trp-1、trp-2的表达几乎没有影响(p > 0.05)。结论黑芝麻水提物在体外能直接刺激b16黑素瘤细胞黑色素的合成，上述变化可能通过促进酪氨酸酶和mitf的基因转录和蛋白表达作用来完成。wWW.11665.cOm

【关键词】  黑芝麻水提物; 酪氨酸酶(tyrosinase); 黑素; 小眼相关转录因子(mitf); 酪氨酸酶相关蛋白酶1(trpl); 酪氨酸酶相关蛋白酶2(trp2)

　　abstract：objectiveto study the effect of water extract from semen sesami nigrum (wes) on cell viability,tyrosinase activity and melanogenesis of b16 murine melanoma cells and to clarify the mechanism of its stimulating effect on melanogenesis.methodsthree different concentrations of wes were incubated with b16 cells for 72h and then cell viability, melanin content，tyrosinase activity were respectively measured. the protein and mrna expression of melanogenesis key enzymes were investigated by western blot and rt-pcr after 48 h treatment of wes.results three different concentrations of wes slightly increased cell viability (p> 0.05). in the range of experimental dose，wes increased the activity of the tyrosinase and melanin content significantly in a dose-dependent manner( p< 0.05). the increasing mrna and protein expression of tyr and mitf were also observed in a dose-dependent manner( p< 0.05).almost no effect was observed on the expression of trp1 and trp2(p> 0.05).conclusion wes can directly stimulate melanogenesis in b16 melanoma cells, which may be induced by increasing expression of tyr and mitf on mrna and protein levels.

　　key words：water extract from semen sesami nigrum; tyrosinase; melanin; microphthalmia associated transcription factor(mitf); tyrosinase-related protein-1(trpl); tyrosinase-related protein-2(trp2)

　　黑芝麻是我国传统的滋补食品，有显著的医疗保健功效。早在几千年前的《本草纲目》中对黑芝麻的功效就有描述：补肝、益胃、精血、润肠、生津、明目、乌发、降压。近年来有研究表明黑芝麻对酪氨酸酶的激活及促黑色素生成方面均具有较强的作用[1,2]，但其分子机理尚不清楚。本实验通过检测黑芝麻水提物对细胞的增殖活性、黑素含量及酪氨酸酶活性的影响，并进行黑素合成的相关基因(tyrosinase/mitf/trp-1/trp-2) mrna和蛋白质表达的测定，从细胞和分子水平上探讨黑芝麻促进黑色素生成的作用机制及对白发治疗的可能性。

　　1 材料

　　1.1 试剂 左旋多巴(l-dopa)，dmso，dmem高糖培养基(美国gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，trizol(invitrogen life technologies)，pcr试剂盒和rt-pcr试剂盒pcr引物购自北京奥科生物技术公司(均购自宝生物大连公司)，多克隆兔抗人酪氨酸酶(tyrosinase)抗体、多克隆兔抗人mitf抗体、多克隆兔抗人酪氨酸酶相关蛋白酶1(trpl)抗体、多克隆兔抗人酪氨酸酶相关蛋白酶2(trp2)抗体和兔抗人肌动蛋白多克隆抗体，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体购自美国santa cruz公司，其他为国产分析纯试剂。

　　1.2 药物的提取 实验用黑芝麻由武汉中医协会陈昌一医生鉴定，提取方法采用索氏提取法，水提后真空冷冻干燥，用dmso配成所需浓度的黑芝麻水提物溶液。

　　1.3 细胞培养 b16黑素瘤细胞株购自武汉大学典型培养物保藏中心。用含10%胎牛血清的dmem培养基37 ℃,5%co2条件下常规培养,待细胞生长至近融合状态，0.25%胰蛋白酶消化，以每瓶约105个细胞传代，每3天传代1次。

　　2 方法

　　2.1 细胞增殖的测定 甲基偶氮唑蓝比色法(mtt)[3]将配制的细胞悬液调整细胞浓度为2×104/ml加入96孔培养板，每孔100 μl，再分别加入不同浓度药物(终浓度为(0.5,1,2 mg/ml)，每一浓度设立3个复孔，取平均值，并设置培养基为对照组。药物作用3 d后，每孔加入5 g/l的mtt溶液20 μl，37°c孵育4 h。弃去上清液,每孔加二甲基亚砜100 μl，选择490 nm波长在酶联免疫检测仪上测各孔吸光度值，以空白孔调零。细胞活力增殖率(%)=(各浓度平均吸光度值÷对照组平均吸光度值)×100%。每一处理因素重复测定3次。

　　2.2 酪氨酸酶活性测定[4]将配制的细胞悬液调整细胞浓度为7×104/ml加入96孔培养板，每孔100 μl，以l-dopa为底物，药物作用3 d后，弃去上清液， 用ph 7.4的pbs洗涤两次，每孔加1%triton x-100溶液90 μl，迅速放入-80 ℃低温冰箱冻存1 h，随后室温融化使细胞裂解，37 ℃ 预温后加入1%l-多巴溶液(10 μl/孔)，37℃反应1 h，测定490 nm吸光度值，以培养基为对照组。每一浓度设立3个复孔，取平均值。酪氨酸酶活性激活率(%)=(各浓度平均吸光度值÷对照组平均吸光度值)×100%。每一处理因素重复测定3次。

　　2.3 黑素含量测定[4] 将培养的第3～4代黑素细胞以1×104 个/cm2 密度接种于6孔板，24 h后换液，再分别加入不同浓度药物(终浓度为0.5,1,2 mg/ml) 作用3 d后，收获细胞,离心后用pbs洗涤两次，加入1 mol/l naoh，置80 ℃水浴中30 min使细胞团块完全溶解,并用双蒸水将naoh的终浓度稀释至0.2 mol/l。用分光光度计在400 nm测定a400值。黑素含量用每个细胞加药处理组a400值占空白对照组a400值的百分率来表示。每一处理因素重复测定3次。

　　2.4 逆转录-聚合酶链式反应(rt-pcr)测定酪氨酸酶及其相关蛋白mrna的表达采用trizol方法(参照试剂说明书)提取用上述浓度的黑芝麻水提物处理48 h的b16鼠黑素瘤细胞株的总rna。引物设计参照hyeong jun kim[5] 。 tyrosinase: 上游,5′-ggccag ctt tca ggc aga ggt-3′; 下游,5′-tgg tgc ttc atg ggc aaa atc-3′。trp-1:上游, 5′-gct gca gga gcc ttc ttt ctc-3′; 下游, 5′-aag acg ctg cac tgc tggtct-3′。trp-2: 上游, 5′-gga tga ccg tgagca atg gcc-3′; 下游, 5′-cgg ttg tgacca atg ggt gcc-3′。 mitf: 上游, 5′-aag tgg tctgcg gtg tct cc-3′; 下游 5′-gtt gtt ggtaaa ggt gat gg-3。 β-actin: 上游,5'-cga gcg gga aat cgt gcg tga cat taa gga ga-3′;下游,5'-cgt cat act cct gct tgc tga tcc aca tct gc-3′。将提取的rna反转录成cdna用于pcr扩增，pcr的反应条件为: 94°c 60 s, 56°c 60 s, 72°c 60 s (26个循环)或20个循环(β-actin)。在含eb的1.5%琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下拍照然后用凝胶成像系统分析，读取cdna荧光强度值，再与对照组相比即为其mrna相对表达量。

　　2.5 蛋白质免疫印迹 黑素细胞培养24 h后，用上述浓度的黑芝麻水提物处理48 h。用刮法收集黑素细胞，溶于triton x一100裂解缓冲物，超声波裂解和涡漩，12 000 r/min ，离心10 min，取上清液1 μl加到800 μl 和200μl染料(dye reagent，bio-rad)混合，读取a595值。根据标准曲线计算蛋白浓度，取20 μl进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，100 v，电泳2 h后转移到硝酸纤维素膜，100 ma，2 h。取膜，封闭液4 °c封闭过夜，洗膜10 min 3次，加入(1∶10 00)多克隆兔抗人酪氨酸酶(tyrosinase)抗体、多克隆兔抗人mitf抗体、多克隆兔抗人酪氨酸酶相关蛋白酶1(trpl)抗体、多克隆兔抗人酪氨酸酶相关蛋白酶2(trp2)抗体和兔抗人肌动蛋白多克隆抗体一抗常温孵育2 h，洗膜10 min 3次，继而与1∶2000的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体孵育2h,常规洗膜,显影，定影，读取结果。用quantity one-4.3.0软件(bio-rad公司)读取蛋白条带的灰度值。

　　2.6 统计学分析 统计学处理采用t检验，全部数据均采用spss10.0 医用统计软件包进行单因素方差分析。

　　3 结果

　　3.1 黑芝麻水提物对b16黑素瘤细胞活性的影响 用mtt比色法测定不同浓度黑芝麻水提物对体外培养的b16黑素瘤细胞作用72h后对细胞活性的影响，从图1可见，黑芝麻水提物的浓度在0.5～2 mg/ml范围内可轻微促进b16黑素瘤细胞的增殖(p> 0.05)。

　　3.2 黑芝麻水提物对b16黑素瘤细胞酪氨酸酶活性和黑色素生成的影响 从图1可见，黑芝麻水提物可以明显促进b16黑素瘤细胞酪氨酸酶的活性，其作用为剂量依赖性。和对照组相比，黑芝麻水提物在2 mg/ml时可以上调酪氨酸酶活性达1.66倍(p< 0.01)。另外，在实验浓度范围内，随药物浓度增高，黑素生成量也不断增加。和对照组相比，黑芝麻水提物在2 mg/ml时使b16黑素瘤细胞黑素的生成量提高了60%(p< 0.01)。

　　3.3 黑芝麻水提物对酪氨酸酶，mitf,trp-1,trp-2 mrna及蛋白表达的影响 3种浓度的黑芝麻水提物作用b16黑素瘤细胞48 h后，各组细胞的tyr，mitf，trpl，trp2的基因和蛋白表达情况见图2。在0.5～2 mg/ml范围内黑芝麻水提物可以明显提高酪氨酸酶和mitf的mrna和蛋白质表达(p< 0.05)，但对trp-1,trp-2的mrna和蛋白的表达影响不大(p> 0.05)。

　　　4 讨论

　　在哺乳动物中，黑色素是在黑素细胞的黑素小体里合成的。它的合成主要由3种酶调控:酪氨酸酶，trp-1,trp-2,这三种酶的基因同属于酪氨酸酶基因家族。其中酪氨酸酶是黑素合成中最为关键的一种限速酶，其表达和活性决定着黑素生成的速度和产量，它催化黑素合成过程的前两步，即羟化l-酪氨酸成l-多巴和氧化后者成为多巴醌;trp-2作为多巴色素互变异构酶，维持黑素中酚的成分，而trp-1则能氧化trp-2产生的5，6-二羟基吲哚羧酸[6，7] 。另外，黑素细胞特异性酪氨酸酶基因家族蛋白受小眼相关转录因子(microphthalmia associated transcription factor，mitf)调节，它是黑色素合成过程中一个重要的转录因子，可以直接上调酪氨酸酶和trp-1蛋白的表达;它作为黑色素细胞的特异性转录因子，对细胞的生长和分化起关键作用，可以直接结合并激活酪氨酸酶启动子，从而促进黑色素的生成[8～11] 。

　　现代医学认为, 白发是因毛球中黑素细胞形成黑色素的功能减退, 酪氨酸酶的活性减低或丧失, 使毛干中缺乏黑色素而引起[12] 。由于目前尚无有效的治疗方法, 为满足美容的需要, 绝大多数患者不得不以染发剂掩饰。然而，过量染发，除了会破坏头发的保护膜、损伤头皮和毛囊，加速毛囊角质化，导致发质变细外，最典型的就是可导致大量脱发，引发意外甚至是重大疾患。因此，开发更具疗效和保健功能的天然中药提取物，从根本上解决黑发变白的问题对于人类来说有着深远的意义，从而也可以改变通过染发来使头发变黑的现状，使得发用品行业更加能满足人们的需要。

　　黑芝麻具有补血生津、润泽皮肤、养发之功效，为滋肝肾、养五脏的理想强壮剂，适用于头发早白、贫血萎黄等症，是美容美发配方中常用药物之一，但目前国内外还没有对此种中药促进黑素合成的相关基因水平的研究。本研究中我们的结果显示，黑芝麻水提物可以剂量依赖性地促进b16细胞中黑色素的生成，其生成量和酪氨酸酶的活性呈正相关;另外在分子生物学水平上也显示出一致性结果，mitf和酪氨酸酶的基因和蛋白表达量在黑芝麻水提物处理48 h后显著提高，以上结果说明黑芝麻水提物是通过提高mitf和酪氨酸酶的基因表达和蛋白合成水平来激活酪氨酸酶的活性，进而促进黑色素的生成量增加。本研究在细胞和分子水平上进一步阐明了黑芝麻对黑素生成和酪氨酸酶的激活作用机制，说明黑芝麻具有一定的开发前景，值得进一步进行活性成分的研究，为黑芝麻的临床应用提供了理论基础，但其具体剂量还有待于动物实验确定。

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