作者：訾勇 张敏州 王磊 郭力恒 张军 温春瑜 杨澄

【摘要】  目的探讨通冠胶囊对血管损伤后内膜增生及vegf表达的影响。方法制备大鼠左颈总动脉球囊损伤模型，将54只sd大鼠随机分为通冠胶囊组、盐水对照组和辛伐他汀对照组，于术后第4周、第8周和第12周处死动物。分别进行取材检测指标：he染色及弹力纤维染色后光镜下观察管壁增生情况，计算机图像分析内、中膜面积及其比值观察通冠胶囊对新生内膜形成的影响。血管内皮生长因子(vegf)免疫组织化学法检测明确损伤后血管内皮修复情况。结果通冠胶囊组在4周、8周和12周时免疫组化vegf表达较盐水对照组明显升高(均p<0.01)，辛伐他汀组的变化趋势与通冠胶囊组相似。通冠胶囊组4周、8周与同时段辛伐他汀组比较无统计学差异(均p>0.05)，12周较辛伐他汀组明显升高(p<0.05)。球囊损伤后4周各组内膜增生明显，8周时形成的增生内膜减少，12周时形成的增生内膜明显减少。通冠胶囊组在损伤后4周、8周、12周形成的增生内膜较盐水对照组显著减少(均p<0.01)，内膜面积与中膜面积的比值较盐水对照组明显降低(均p<0.01)。结论通冠胶囊可以促进大鼠颈总动脉球囊损伤处的vegf的表达，并减少新生内膜的形成。Www.11665.com

【关键词】  通冠胶囊; 大鼠颈动脉; 球囊损伤; 血管内膜; 血管内皮生长因子

　　abstract：objectiveto observe the effects of tongguan capsule on the expression of vascular endothelial growth factor and intimal hyperplasy in tunica intima in rats after balloon injury.methods60 male sprague-dawley rats whose left common carotid arteries were injured were randomly divided into 3 groups (n=18) :group l(10mg·kg-1·d-1 of ps was given after injury)，group 2(2mg·kg-1·d-1 of simvastatin was given after injury)and group 3(600mg·kg-1·d-1 of tongguan capsule was given after injury). 18 rats from each group were euthanized by exsanguination in week 4,week 8 and week 12 after injury .the injured left common carotid arteries were carefully removed for he and elastic fibers staining.intima area,media area and ia/ma were performed in ipp6.0.which is an automatic computerized imaging analysis system.to observe the reparation after injury of blood vessel endothelium through detection of vegf with immunohistochemistry.resultsin comparison with group l, the expression of vegf in tunica intima in rats after balloon injury in group 3 increased obviously(p<0.01).the changes of the expression of vegf of group 2 were similar to group 3. the expression of vegf of group 3 increased obviously in week 12(p<0.05).4 weeks after the operation，morphological analysis demonstrated that there were marked differences in the area of neointima proliferation among all the groups.conclusiontongguan capsule can improve the expression of vegf in tunica intima in rats after balloon injury and inhibit intimal hyperplasia of injured vascular.

　　key words：tongguan capsule; rat carotid artery; balloon injury; tunica intima; vegf

　　目前普遍认为血管内膜增生在粥样斑块以及血管成形术后再狭窄的形成过程中都起到了关键性的作用。内皮细胞结构和功能损伤是动脉粥样硬化(atherosclerosis，as)、冠心病介入治疗后再狭窄(restenosis，rs)共有的始动病理机制[1，2]。vegf是一种二聚体糖蛋白,特异作用于血管内皮细胞,促使内皮细胞增殖、新血管再生。在冠心病自然病程中,冠状动脉粥样硬化导致不同程度的心肌缺血,心肌能逐渐建立自身的侧枝循环,靠代偿性血管新生适应心肌局部的缺血缺氧,其新生的血管现认为与vegf有关[3]。从vegf着手，有可能成为抑制内膜增生的新策略。本研究利用大鼠左颈总动脉球囊损伤模型，观察通冠胶囊对于血管损伤后内膜增生的影响，并探讨其可能机制。

　　1 材料

　　vegf免疫检测试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司(一抗)、上海西唐科技有限公司(二抗)。日本olympus公司cha-213w型显微镜。通冠胶囊由广东省中医院制剂科提供(0.5g/粒,生产批号：07110504)，舒降之片(辛伐他汀，40 mg/片，生产批号：08023)由默沙东制药有限公司提供。

　　2 方法

　　2.1 动物分组雄性sd大鼠54只，spf级，体重180～220 g，由南方医科大学实验动物中心提供，许可证编号：scxk(粤)2003-0001。将54只大鼠随机分为3组，各18只。辛伐他汀组：造模后，给予2 mg·kg-1·d-1;通冠胶囊组：造模后，给予600 mg·kg-1·d-1;生理盐水对照组：造模后，给予10 ml·kg-1·d-1。以上3组分别于术后4周、8周、12周取材，每个时间段每组各6只。

　　2.2 模型复制采用100mg/l水合氯醛溶液，按400mg/kg 腹腔麻醉大鼠，取仰卧位固定，常规消毒大鼠颈前皮肤,取颈部正中切口，从颈外静脉注射肝素钠100 u/kg，寻找到左颈总动脉和颈外、颈内动脉分叉处，在左颈总动脉近心端暂时阻断血流，靠近分叉处用血管分离棒分离颈外动脉，其近心端和远心端各穿一4号丝线待用。从颈外动脉处将1.5f forgaty导管插入至颈总动脉约1.5 cm，在直视下观察球囊的插入深度，肝素生理盐水充盈球囊，缓慢回抽球囊至动脉分叉处，反复3次剥脱内膜。将导管撤出后，结扎颈外动脉近段，去除血管夹，恢复血流，查看颈总动脉和颈内动脉搏动良好。缝合伤口，送回动物观察室，腹腔注射青霉素预防感染。

　　2.3 标本采集及处理用100 mg/l水合氯醛溶液腹腔注射麻醉大鼠，取出损伤部位的左颈总动脉约2 cm长，pbs缓冲液反复冲洗后置入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，石蜡包埋病理切片，每个标本均匀间断切片8张，切片厚度3 μm。切片行he染色、弹力纤维染色及vegf免疫组化染色。在光镜下观察血管内膜增生情况，以内弹力板和外弹力板为标准区分内膜、中膜和外膜。vegf免疫组化染色采用sp法，石蜡切片脱蜡至水化，3%双氧水阻断内源性过氧化物酶10 min，微波修复抗原10 min，正常羊血清37℃封闭20 min，甩掉封闭液，滴加稀释的兔抗大鼠vegf一抗(1∶250)37℃孵育1h，取出以0.01 mol/l pbs漂洗3次后，加入稀释的山羊抗兔igg二抗(1∶10 000)37℃孵育30 min，再取出以pbs漂洗3次，滴加辣根过氧化物酶标记的链亲和素37℃孵育40 min，再取出以pbs漂洗3次，dab显色5～10 min，显微镜下观察至出现阳性着色，以蒸馏水冲洗终止反应，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。vegf阳性表达呈棕黄色，表达主要位于血管内膜损伤处，细胞内及细胞外间质均有表达。

　　2.4 图像分析及统计学处理在普通光镜下固定各种光学参数，对标本进行扫描，以tiff格式存入电脑;用image pro plus 6.0软件进行图像分析。(1)通过血管he染色及弹力纤维染色计算：管腔面积(lumen area,la)内膜面积、中膜面积、内膜和中膜面积比(intima area/media area，ia/ma)。①在40倍视野偏振光光镜下，固定显微镜的各项光学常数，对损伤血管进行扫描，图像以tiff格式存入电脑;②在image pro plus 6.0环境下打开一幅图像，利用软件中的count and size功能自动计算出la、内弹力板包绕面积(internal elastic area,iea)、外弹力板包绕面积(external elastic area,eea)，再计算出内膜面积(iea-la)和中膜面积(eea-iea)，并计算ia/ma。(2)用江苏省捷达科技发展有限公司的jd801数码医学显微图像分析系统在400倍放大倍数下,连续扫描5个视野,读取平均光密度值作为vegf的相对表达量。各值以(±s)表示，用spss11.5统计软件包进行数据处理，组间差异性比较用单因素方差分析，组间两两比较用lsd检验法。

　　3 结果

　　3.1 组织学观察正常大鼠颈动脉内膜为单层内皮细胞，中膜由4～5层环行排列呈波浪状的弹性膜和平滑肌细胞组成，外膜由结缔组织组成。球囊损伤后，可见动脉内皮剥脱，个别处内弹力板破裂，内弹力板由正常时的波浪状变平坦，失去弹性。球囊损伤后4周内膜增生明显，8周形成的增生内膜有少量减少，12周时形成的新生内膜减少明显。空白盐水组球囊损伤后4周内膜增生达到高峰。通冠胶囊使损伤后4周、8周、12周形成的ia较盐水对照组显著减少(均p<0.01)(见表1，图1)，ia/ma较盐水对照组明显降低(均p<0.01);与4周、8周同时段辛伐他汀组内膜面积及ia/ma无统计学差异。与12周辛伐他汀组内膜面积及ia/ma比较，差异有显著性意义(均p<0.05)。辛伐他汀组的变化趋势与通冠胶囊组相似，与同时段盐水对照组比较有显著性差异(均p<0.01) (见表2，图2)。表1 各组大鼠损伤颈动脉不同时段内膜面积的比较表2 各组大鼠损伤颈动脉不同时段ia/ma的比较与同时段盐水对照组比较，△△p<0.01;与同时段辛伐他汀组比较，*p<0.05

　　3.2 vegf免疫组织化学检测通冠胶囊组、辛伐他汀组分别与盐水对照组比较，术后4周、8周和12周时差异均有显著性(p<0.01)见表3。4周、8周通冠胶囊组与辛伐他汀组比较无统计学差异。12周时通冠胶囊组较辛伐他汀组vegf表达增高明显(p<0.05)见表3、图3。表3 各组大鼠损伤颈动脉不同时段vegf的比较(od值与同时段盐水对照组比较，△△p<0.01;与同时段辛伐他汀组比较，*p<0.05

　　4 讨论

　　目前以ptca和支架置入为代表的经皮冠状动脉介入治疗已成为治疗冠心病的重要手段，但是介入治疗后的再狭窄是困扰医学界的难题，也是近年来研究的热点。目前认为再狭窄是血管对抗损伤的一种异常修复反应， 表现为过度的组织增生。其机制主要在4个方面：术后血管的收缩重构、局部的弹性回缩与炎症、血栓形成以及血管内膜增生[4]。支架植入后避免了血管弹性回缩及血管负性重构，其再狭窄主要原因是内膜增生。血管成形术及支架植入术机械性扩张不可避免地导致血管内皮细胞损伤， 受损的内皮细胞一氧化氮和前列环素分泌减少，炎症细胞浸润，抗血小板聚集和抗血栓形成的作用减弱，血管的舒缩功能失调， 局部的炎症发生和血栓的形成使得血管内皮细胞的屏障作用消失，抗增殖作用减弱， 血管平滑肌细胞在内皮缺失的部位移行和过度增殖，从而导致血管再狭窄的发生[5]。vegf是内皮细胞特异性促有丝分裂原,具有促进内皮细胞增殖,增加微血管通透性、诱导血管生成等多种功能[6]。研究发现内皮祖细胞(epcs)在受损血管内皮的自我修复中发挥重要作用[7]，而vegf既可促进epc动员，又可促使其归巢[8]。vegf等细胞因子可能通过对骨髓源内皮祖细胞的正性调控,动员其进入外周血,促进其转化为成熟的内皮细胞,达到促进血管再生和增强血管内皮化的作用[9]。

　　中医理论认为，ptca后再狭窄属“胸痹”“心痛”病范畴，其病位在心之络脉，基本病机是脏气亏虚、瘀血阻络，气虚血瘀是其根本的病理改变，根据陈可冀院士“血瘀证”理论和邓铁涛教授“心脾相关”学术思想，益气活血、祛瘀生新是主要的治疗原则。通冠胶囊是基于此原则而开发的有效方剂，主要用于冠心病心绞痛及冠心病介入术后的药物，由黄芪、丹参等药组成，有益气活血通络之功。前期实验证实通冠胶囊能够抑制球囊损伤家兔血管后的平滑肌增殖[10]，升高心肌缺血小鼠enos表达促进no活性对内皮细胞具有保护作用[11]。

　　本实验提示通冠胶囊对损伤后血管内膜的增生有明显抑制作用。通过vegf免疫组织化学检测通冠胶囊组、辛伐他汀组分别与盐水对照组比较，术后4周、8周和12周时差异均有显著性，在12周时vegf的表达通冠胶囊组较辛伐他汀组有显著增加，由此可以证实通冠胶囊可抑制血管内膜的增生，从长期来看作用甚至优于辛伐他汀，其机制可能是通过血管内膜的vegf的表达增殖从而促进epcs的动员、归巢及分化到内皮损伤处而达到修复损伤动脉的作用。我们的研究表明，益气活血法是治疗ptca术后再狭窄的有效方法[12]，而通冠胶囊正是以益气活血为法拟方而成，是防治冠心病、预防再狭窄的有效方剂，这种作用可能是通过多种途径实现的，这可能也是中药复方成分的优势所在。

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　　[12] 张敏州.胸痹心痛与冠心病介入[m].北京：科学出版社，2007：338.