作者：曾靖， 黄玉萍， 黄玉珊， 王树人
【摘要】 目的研究3'-大豆苷元磺酸钠(dss)对氧化低密度脂蛋白诱导脐静脉内皮细胞损伤的保护作用及其机制。方法体外培养脐静脉内皮细胞，将细胞分为空白对照组、氧化损伤对照组(ox-ldl)、氧化损伤加入维生素e对照组(ve+ox-ldl)、氧化损伤加入dss低、中、高浓度组(dss-l、dss-m及dss-h组)。将ox-ldl作用于预先加入ve及不同浓度dss预处理24 h的内皮细胞，继续培养24h，mtt法检测细胞活力，比色法检测丙二醛(mda)及一氧化氮(no)的含量，检测乳酸脱氢酶(ldh)、超氧化物歧化酶(sod)、一氧化氮合酶(nos)及谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)的活性。结果预先加入ve、中高浓度的dss可提升损伤的内皮细胞的活力，可显著降低损伤内皮细胞的mda及no的释放，可显著提升损伤细胞的ldh、nos、sod和gsh-px的活性，但低浓度的dss对上述指标影响不大。结论dss可减轻ox-ldl对血管皮细胞的氧化损伤，起到一定的抗氧化保护作用。
【关键词】 3'-大豆苷元磺酸钠; 氧化性低密度脂蛋白; 内皮细胞; 保护效应
abstract：objectiveto investigate the protective effect and mechanisms of 3'-daidzein sulfonate sodium on vascular endothelial cell injury induced by oxidized low-density lipoprotein. methodshuman umbilical vein endothelial cells(huvecs) were cultured in vitro and divided into 5 groups:control，ox-ldl, ve+ox-ldl, dss-l，dss-m and dss-h groups. endothelial cells were incubated with ox-ldl for 24 hours after they were incubated with vitamin e(ve) and different doses of dss for 24 hours. the proliferation of huvecs was assayed by the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide method，and the levels of no and mda，the activities of ldh, sod, nos and gsh-px were measured. resultsthe level of mda and the activity of ldh in ox-ldl damaged group were remarkably higher than those in ve，dss-m and dss-h groups. the activities of sod，nos，gsh-px and the concentration of no in ox-ldl damaged group were lower than those in ve，dss-m and dss-h groups. there was no significant difference between dss-l group and ox-ldl group. conclusion3'-daidzein sulfonate sodium has protective effect on huvecs injury induced by ox-ldl，which may be related to increasing the antioxidant capacity of huvecs.
key words：3'-daidzein sulfonate sodium; oxidized ldl; endothelial cell; protective effect
血管内皮是介于血液与血管壁组织之间的一层上皮组织，它不仅是一种机械屏障，还具有物质转运、自分泌、旁分泌等多种功能，在创伤修复、血管生成、止血、血栓形成、动脉粥样硬化等一系列生理和病理过程中起着重要作用。wWW.11665.Com氧化低密度脂蛋白(ox-ldl)所致内皮细胞损伤是动脉粥样硬化形成的一种重要因素，寻找有效的抗氧化剂防止血管内皮细胞氧化损伤一直是人们在心血管疾病研究领域关注的重点。
葛根是一种治疗绝经期症状的中国传统中草药，可用于某些绝经期妇女的症状，如骨质疏松症、冠心病及某些激素依赖性肿瘤等[1]。3'-大豆苷元磺酸钠( 3'-daidzein sulfonate sodium，dss)是葛根的主要有效成分大豆苷元的强水溶性衍生物。其水溶性极强[2]，具有比大豆苷元更强的生理活性[3]。本课题组前期研究发现dss具有抗缺氧缺血作用[4]，但由于大豆苷元不溶于水，在实际应用中存在着生物利用度低、服用量大和显效慢等缺点，体外研究发现其具有抗氧化作用[5]，但目前尚无dss对人体细胞水平的抗氧化研究。因此，本研究采用体外培养人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，huvecs)，以ox-ldl作为损伤因素，观察dss对ox-ldl致huvec氧化损伤的拮抗作用，从细胞水平探讨dss的抗氧化功能，以其为dss在心脑血管疾病防治中的临床应用提供更坚实的基础。
1 药品与试剂
3'-大豆苷元磺酸钠，分子式c15h9o7sna，结构式见图1。类白色结晶粉末，由沈阳药科大学植化教研室提供，纯度98%以上。实验前用生理盐水稀释至所需浓度，用nahco3调ph至7.0备用。
图1 3'-大豆苷元磺酸钠的化学结构式
m199细胞培养基为gibco公司产品，新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所公司，ii型胶原酶及胰蛋白酶均为sigma公司产品，ⅷ因子相关抗原免疫组化染色试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。
丙二醛(mda)测定试剂盒、超氧化物歧化酶(sod)活性测定试剂盒、乳酸脱氢酶(ldh)测定试剂盒，谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)活性测定试剂盒、一氧化氮(no)及一氧化氮合酶(nos)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
2 方法
2.1 人脐静脉内皮细胞[6]的培养取四川大学华西第二医院健康剖宫产分娩的新生儿脐带，d-hank’s液冲洗，注入0.1%ⅱ型胶原酶消化15 min，收集酶液，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入含20%fsm的m199细胞培养基重悬，以2×105/ml的密度接种于培养甁中，置于37℃，饱和湿度，5% co2孵箱培养。待细胞长满甁后，0.1%胰蛋白酶消化传代，选用3～5代细胞用于实验。经细胞形态学观察和ⅷ因子相关抗原免疫组织化学染色鉴定结果。
2.2 人低密度脂蛋白(ldl)的分离、提取健康人血浆购自成都市中心血站，按照密度梯度超速离心法[7]分离ldl。血浆铺于密度梯度液上层后置超速离心机做超速序列离心，提取的ldl以含0.01% edta的tris-hcl缓冲液(ph7.6)4℃透析48 h，过滤除菌，考马斯亮蓝g-250法定量蛋白，以琼脂糖凝胶电泳法鉴定其纯度。
2.3 氧化低密度脂蛋白(ox-ldl)的制备将ldl置于pbs溶液中，4℃透析36 h，充分去除edta后，用含10 μmol/l cuso4的pbs溶液(ph=7.2)，4℃避光氧化24 h，进行氧化修饰，氧化后的ldl的顔色由原来的淡黄变为乳白色。氧化修饰后的ldl置含0.01% edta的pbs中，4℃透析24 h，终止氧化，超滤除菌，定量蛋白，4℃贮存, 一周内使用。
2.4 实验分组实验分为空白对照组(control)、氧化损伤对照组(1 nmol/lmda含量的ox-ldl)、ox-ldl+ve对照组(50 μm ve+ox-ldl)、dss-l组(50 μm dss+ox-ldl)、dss-m组(100 μm dss +ox-ldl)及dss-h组(150 μm dss +ox-ldl)。
取传代培养生长融合成单层的细胞，倾去培养液，用pbs液洗2～3遍，换新细胞培养液，按实验剂量分组要求加入ve、dss预孵24 h，再与除菌后的ox-ldl继续培养24 h，终止培养后进行后续实验。
2.5 细胞活力的检测(mtt法)huvec以每孔5×103个细胞接种于96孔板，每组3个平行孔，加入含10%小牛血清的m199培养基，24h后，用d-hanks液冲洗两遍，按分组要求加入含ve及不同浓度dds的2%小牛血清的m199培养基，预孵24h，再与除菌后的ox-ldl继续培养24 h。每孔加入pbs溶解的 mtt 5 g/l 20 μl，4 h后弃去培养基，加入200 μl dmso。摇匀10 min, 于570 nm测量吸光度。实验重复3次，每组设6个平行复孔，取均值。
2.6 mda，sod，no，gsh-px，ldh及nos的测定细胞终止培养后，收集细胞培养液，按南京建成生物工程研究所提供试剂盒操作说明，检测内皮细胞培养液中的mda，no的含量，检测sod，gsh-px，ldh及nos的活性。实验重复3次，每组设6个平行复孔，取均值。
2.7 数据处理实验数据采用±s表示。运用spss 11.0统计软件包对组间均数做单因素方差分析。
3 结果
3.1 细胞活力的检测与空白对照组相比，ox-ldl损伤组细胞活力明显下降，而ve可明显拮抗ox-ldl的损伤作用，细胞活力明显恢复;低浓度的dss拮抗ox-ldl的作用不明显，而中高浓度组均表现出明显的拮抗ox-ldl的损伤作用，且随着浓度的增加，拮抗作用也明显增强 (图2)。
图2 各组细胞活力的状况(与ox-ldl组相比，*p<0.05，n=18)
3.2 mda，sod，no，gsh-px，ldh及nos的检测结果与空白对照组相比，ox-ldl组mda、ldh含量显著增高，而no含量、nos活性、sod 活性和gsh-px活性均显著低于对照组;预先加入ve、中高浓度的dss可使mda及ldh含量降低，增加no含量，提升nos活性、sod 活性、ldh活性和gsh-px活性，但低浓度的dss对上述指标影响不大。结果见表1。表1 dss对ox-ldl损伤huvecs mda，ldh，no，sod，nos及gsh-px的影响与ox-ldl组相比，*p<0.05，**p<0.01，n=18
4 讨论
动脉粥样硬化(atherosclerosis，as)正是心脑血管疾病发生的重要病理基础，内皮细胞损伤及其功能异常是动脉粥样硬化形成的始动环节，血液中过量的ldl，尤其是ox-ldl是引起内皮细胞损伤的一个重要的有害因子[8]。近年来的研究发现ox-ldl可通过增加氧自由基浓度，同时抑制或损伤细胞本身的抗氧化防御系统，降低其清除氧自由基的能力等机制，使细胞受损[9]。因此，使用有效的抗氧化剂，改善脂质代谢，可有效地保护血管功能并拮抗as的形成。
本研究结果显示，预先使用dss可有效地拮抗ox-ldl产生的损伤作用，可降低mda及ldh含量，增加no含量，并提升nos活性、sod 活性和gsh-px活性，是良好的抗氧化剂。
【参考文献】
[1] jean w，edith l，suzanne c, et al. comparison of pueraria lobata with hormone replacement therapy in treating the adverse health consequences of menopause[j].menopause,2003,10(4) 352.
[2] 董社英, 郑建斌, 高 鸿.3'-大豆苷元磺酸钠的电化学行为及应用研究[j].化学学报 , 2003, 61(4): 487.
[3] 刘谦光，张尊听，薛 东，等.大豆苷元磺化物的合成、晶体结构及活性研究[j].高等学校化学学报, 2003, 24(5): 820.
[4] 曾 靖，曾昭毅，黄志华，等.3'-大豆苷元磺酸钠的耐缺氧作用[j].中国临床康复，2006, 10(23): 130.
[5] 师梅梅，杨建雄，张改平,等.3′-大豆苷元磺酸钠的体外抗氧化研究[j].天然产物研究与开发，2008，20(4)：698.
[6] jaffe ea, nachman rl, becker cg, et al. culture of human endothelial cells derived from umbilical veins identification by morphologic and immunologic criteria[j]. j clin invest, 1973, 52(11): 2745.
[7] 张林华，刘秉文.一次性密度梯度超速离心分离人血清脂蛋白[j].生物化学与生物物理学报，1989，21：257.
[8] parthasarachy s，stainberg d，witztum j l.the role of oxidized low-density lipoproteins in the pathogenesis of atherosclerosis[j].ann rev med，1999，43：219.
[9] 黄从刚，魏劲波.自由基及其清除剂对动脉粥样硬化的影响[j].医学综述，1998，4(4)：166.
