【摘要】  目的 探讨血管内皮生长因子(vegf)、表皮生长因子受体(egfr)、cd44v6、cath-d、nm23-h1在结直肠癌组织中的表达及临床意义。方法 选择2000年1月至2001年12月行根治性手术的131例结直肠癌病例，应用免疫组化sp法检测肿瘤组织中vegf、egfr、cd44v6、cath-d及nm23-h1的表达情况，分析其与术后复发转移的关系。结果 全组术后复发转移率为31.3％（41/131），vegf、egfr、cd44v6、cath-d、nm23-h1阳性率分别为62.6％(82/131)、58.0％(76/131)、52.7％(69/131)、55.0％(72/131)、72.5％（95/131），vegf阳性组、egfr阳性组、cd44v6阳性组、cath-d阳性组、nm23-h1阴性组术后复发转移率较高（p值均<0.05）。根据vegf、egfr、cd44v6、cath-d、nm23-h1的表达情况对患者进行评分再分成3组，3组间的术后复发转移率两两间存在统计学差异（p值均<0.05）。结论 vegf、egfr、cd44v6、cath-d、nm23-h1与结直肠癌术后复发转移有关，合并这些不良预后因素越多，患者的预后越差。

【关键词】  结直肠癌；复发转移；血管内皮生长因子；表皮生长因子受体；cd44v6；cath-d；nm23-h1

    the expression of vegf，egfr，cd44v6，cath-d and nm23-h1 in colorectal cancer

    gong zhijun,ren jingqing,zhou wei,et al. department of gastrointestinal surgery, jiangmen central hospital, jiangmen 529030, china

    ［abstract］  objective  to study the expression of vegf，egfr，cd44v6，cath-d and nm23-h1 in colorectal cancer. methods  data of 131 cases with colorectal cancer after curative resection from january 2000 to december 2001 were analyzed retrospectively. the expression of vascular endothelial growth factor (vegf), epidermal growth factor receptor (egfr), cd44v6, cathepsin d(cath-d)and nm23-h1 were detected by immunohistochemical method in primary tumors. the correlation between expression of vegf， egfr， cd44v6， cath-d and nm23-h1 and recurrence of colorectal cancer after curative resection was analyzed. results  the overall recurrence rate was 31.3%. the positive rate of vegf, egfr, cd44v6, cath-d and nm23-h1 were 62.6％(82/131),58.0％(76/131), 52.7％(69/131), 55.0％(72/131) and 72.5％（95/131）, respectively. positive expression of vegf, egfr, cd44v6 and cath-d and negative expression of nm23-h1 were associated with an increased incidence of recurrence (p<0.05). when 131 patients were divided into three groups according the expression of vegf，egfr，cd44v6，cath-d and nm23-h1, there was statistical difference in the recurrence rate among the three groups(p<0.05). conclusion  positive expression of vegf, egfr, cd44v6 and cath-d and negative expression of nm23-h1 are associated with an increased incidence of recurrence of colorectal cancer after curative resection.

    ［key words］  colorectal cancer；recurrence；vascular endothelial growth factor；epidermal growth factor receptor；cd44v6；cath-d；nm23-h1

    结直肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤，临床上主要采用以手术为主的综合治疗，但效果并不理想，近40年来患者术后5年生存率一直徘徊在50%～60％，治疗失败的主要原因是肿瘤局部的复发和转移。WWw.11665.cOM近年来的研究表明，多种生物学指标与结直肠癌术后的复发转移有关，本文采用免疫组化方法，探讨vegf、egfr、cd44v6、cath-d、nm23-h1在结直肠癌组织中的表达及临床意义。

    1  资料与方法

    1.1  一般资料  2000年1月至2001年12月间，在江门市中心医院行根治性手术的结直肠癌病例共153例，排除多原发结直肠癌、家族性腺瘤性息肉病（familial adenomatous polyposis，fap）、同时或既往患其它恶性肿瘤、术后3个月内复发转移或死亡的病例，共131例纳入本组分析。全组男72例，女59例；中位年龄56岁（23～82岁）；结肠癌69例，直肠癌62例；dukes a期18例，b期65例，c期48例。全部病例均经病理检查确诊，复发转移病例经病理、ct、b超、x光检查四项中至少一项证实。

    1.2  随访  术后第1年每3个月随访1次，以后每6个月随访1次，随访截止时间为2006年10月，中位随访时间52个月（6～73个月）。本组共11例失访，随访率为91.6％。

    1.3  免疫组化方法  鼠抗人vegf、egfr、cd44v6、nm23-h1 单克隆抗体和sp试剂盒由美国zymed公司生产，兔抗人cathepsin-d 多克隆抗体由美国anta cruz公司生产。将入选病例的原发灶病理蜡块进行常规切片，制成4 μm厚的切片，0.01 mol/l柠檬酸盐缓冲液微波抗原修复，sp免疫组化染色。染色步骤严格按照说明书进行，dab显色，苏木精复染细胞核，pbs代替第1抗体作阴性对照。

    1.4  结果判断  细胞膜和（或）细胞质出现棕黄色细颗粒为阳性细胞，阳性表达判断标准［1,2,3］如下：vegf阳性细胞数占瘤细胞数5％以上，egfr阳性细胞数占瘤细胞数25％以上，cd44v6阳性细胞数占10％以上；cath-d阳性细胞数占25％以上，nm23-h1阳性细胞数占20％以上。

    1.5  统计学分析  采用spss13.0统计软件进行统计分析，两因素差异的比较采用χ2检验，p<0.05表明有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  术后复发转移情况  全组总的术后复发转移率为31.3％（41/131），局部复发率为11.5％（15/131），远处转移率为24.4％（32/131）。术后复发转移的中位时间为12个月（3～46个月），术后复发转移在2年内出现者占73.2％（30/41），在3年内出现者占82.9（34/41）。

    2.2  vegf、egfr、cd44v6、cath-d和nm23-h1阳性表达情况  vegf、egfr、cd44v6、cath-d、nm23-h1阳性率分别为62.6％(82/131)、58.0％(76/131)、52.7％(69/131)、55.0％(72/131)、72.5％（95/131）。

    2.3  vegf、egfr、cd44v6、cath-d和nm23-h1与术后复发转移的关系  χ2检验结果显示，vegf、egfr、cd44v6、cath-d阳性表达者术后复发转移率较高（p值均<0.05），nm23-h1阴性表达者术后复发转移率较高（p<0.05），见表1。表1  各指标与结直肠癌术后复发转移的关系（略）根据vegf、egfr、cd44v6、cath-d和nm23-h1的表达情况对每例患者进行评分（vegf、egfr、cd44v6和cath-d每一项阳性表达者均记1分，阴性表达者记0分，nm23-h1阴性表达记1分，阳性表达记0分），根据评分结果对患者重新分组：ⅰ组（0～1分）、ⅱ组（2～3分）、ⅲ组（4～5分），比较3组的术后复发转移率。χ2检验结果显示，3组间的术后复发转移率两两间存在统计学差异（p值均<0.05），见表2。表2  3组的术后复发转移率比较（略）

    3  讨  论

    复发转移是导致手术失败和患者死亡的主要原因，是影响患者术后生存率至关重要的因素，因此确定术后复发转移的高危因素具有重要意义。目前结直肠癌的主要分期系统是dukes分期/tnm分期，预后的估计及治疗方案的选择也是主要根据此分期系统进行的，但无论是dukes分期还是tnm分期，并不能完全反映出肿瘤的生物学行为及患者的预后情况，在临床实践中，经常发现同一分期、同一病理类型、采用同一治疗方案的患者，其疗效可存在明显差异，这可能是肿瘤恶性程度差异或转移潜能有所不同所致。因此，寻找及发现影响结直肠癌预后的指标，根据这些指标的差异正确判断患者的预后，在规范化治疗的原则下进行个体化治疗必将成为结直肠癌治疗上的发展方向。

    vegf是1989年ferrara等从垂体滤泡细胞中分离出的一种高度特异性促血管内皮细胞有丝分裂的生成因子，是目前已知的作用最强的促血管形成因子之一，通过促进肿瘤新生血管的形成使肿瘤的生长加快，vegf与结直肠癌微血管计数有明确关系，vefg还可诱导淋巴管增生和扩张，使肿瘤细胞进入淋巴管和淋巴结导致转移［4］，vegf还可通过抑制树突状细胞成熟诱导免疫抑制，这是肿瘤细胞发生免疫逃逸的重要原因之一［5］。meta分析［6］结果表明，vegf阳性表达者具有较高的术后复发转移率和较低的生存率。动物实验及临床研究［7,8］亦表明，针对vegf的靶向治疗能明显抑制结直肠癌远处转移。

    egfr具有酪氨酸激酶（tyrosineproteinkinase，tpk）活性，与egf结合后，其自身酪氨酸残基磷酸化而使其构像发生改变，tpk活性升高，催化细胞内某些底物蛋白质的酪氨酸残基磷酸化，导致细胞增殖信息传递，促进肿瘤细胞的生长及局部浸润能力，增强转移趋势。有研究［9］发现，egfr 阳性的结直肠癌细胞增殖活性明显高于egfr 阴性的结直肠癌细胞。本研究结果表明，egfr是结直肠癌不良的预后影响因素，egfr（+）者术后39.5％出现复发转移，而egfr（-）者仅有20.0％，这与galizia1等［10］的研究结果相似，其研究结果表明，egfr是结直肠癌独立的不良预后因素，egfr（+）术后5年59.2％出现复发转移，而阴性者只有17.5％。而针对egfr的靶向治疗药物c225已经应用于常规化疗无效的晚期结直肠癌患者，并且显示出良好的临床疗效［11］。

    cd44是肿瘤细胞表面的粘附因子，一种跨膜透明质酸受体，介导与内皮细胞的粘附。cd44v6是cd44的变异体，可能通过促进肿瘤细胞与血管内皮细胞和细胞外基质的粘附，促进肿瘤细胞向基质侵袭，影响肿瘤细胞骨架蛋白的聚集和分布，从而影响肿瘤细胞的迁移和运动能力［12］。同时，肿瘤细胞表达cd44变异体可以在转移过程中逃避宿主免疫系统的识别而免于被清除。gunthert等［13］发现cd44v6仅在两种转移性大鼠肿瘤细胞系表达，在非转移性肿瘤细胞系和正常大鼠体内不表达，将cd44v6的cdna 转染到非转移性肿瘤细胞系并使其过度表达，可使后者获得转移特征。若将已转染该cdna 的细胞系接种到大鼠体内，短期内就可在引流淋巴结形成转移灶，如果同时在该大鼠静脉内注入cd44v6特异单抗，能明显抑制转移灶的形成［14］。本研究结果显示，cd44v6的阳性表达组术后复发转移率明显高于阴性组(44.9％ vs 16.1％，p＝0.001)。vizoso等［15］的研究结果亦显示，cd44v6的阳性表达者具有较低的术后无瘤生存期和总生存期，cd44v6是结直肠癌独立的不良预后因素。

    cath-d是一种天门冬氨酸肽链内切酶，对基底膜的多种组织成分有降解破坏作用，有利于恶性肿瘤细胞的浸润和转移。arao等［16］的研究结果显示， cath-d的表达与结直肠癌淋巴管浸润有关。本研究结果显示，cath-d阳性者术后复发转移率较阴性者高(40.3％ vs 20.3％，p＝0.022)。

    nm23-h1基因是一种肿瘤转移抑制基因，通过调节细胞内微管系统的状态和阻断肿瘤信息传递而抑制细胞增殖。动物实验［17］表明，转染了nm23-h1基因的小鼠结肠癌细胞肝转移的能力明显降低。本研究结果显示，nm23-h1阴性者术后复发转移率较高，这与dursun［18］的研究结果相似。而dusonchet［19］则认为nm23-h1异常表达与结直肠癌复发转移及生存期无关。因此，nm23-h1在结直肠癌中的功能有待进一步明确。

    本研究结果显示，vegf、egfr、cd44v6、cath-d、nm23-h1的表达与结直肠癌的术后复发转移有关，且合并这几个因素越多，患者术后复发转移率也越高，表明同时检测多个相关基因的表达能更准确地判断结直肠癌的生物学特征以及患者的预后情况。

【参考文献】
  ［1］ ishigami si，arii s，furutani m，et al.predictive value of vascular endothelial growth factor (vegf) in metastasis and prognosis of human colorectal cancer［j］. br j cancer，1998，78（10）：1379-1384.

［2］ reinarta jj，george e，lindgren br，et al. expression of p53，transforming growth factor alpha，epidermal growth factor receptor and cerbb-2 in endometrial carainoma and correlation with survival and know predictors of survival［j］. hum pathol，1994，25（10）：1075-1083.

［3］ koukoulis gk，patriarca c，gould ve，et al. adhesion molecules and tumor metastasis［j］. hum pathol，1998，29（9）：889-892.

［4］ yonemure y，endo y，fujital h，et al. role of vascular endothelial growth factor c expression in the development of lymph node metastasis in gastric cancer［j］. clin cancer res，1999，5：1823-1829.

［5］ della porta m，danova m，rigolin gm，et al. dendritic cells and vascular endothelial growth factor in colorectal cancer：correlations with clinicobiological findings［j］. oncology，2005，68（2-3）：276-284.

［6］ guetz gd，uzzan b，nicolas p，et al. microvessel density and vegf expression are prognostic factors in colorectal cancer. meta-analysis of the literature［j］. br j cancer，2006，94（12）：1823-1832.

［7］ hurwitz h. integrating the anti-vegf-a humanized monoclonal antibody bevacizumab with chemotherapy in advanced colorectal cancer［j］. clin colorectal cancer，2004，4（2）：62-68.

［8］ takahashi y，mai m. antibody against vascular endothelial growth factor(vegf) inhibits angiogenic swith and liver metastasis in orthotopic xengraft model with sitedependent expression of vegf［j］. j exp clin cancer res，2005，24（2）：237-243.

［9］ tong wm，ellinger a，sheinin y，et al. epidermal growth factor receptor expresion in primary cultured human colorectal carcinoma cells［j］. br j cancer，1998，77（11）：1792-1798.

［10］ galizia1 g，lieto1 e，ferraraccio f，et al. prognostic significance of epidermal growth factor receptor expression in colon cancer patients undergoing curative surgery［j］. ann surg oncol，2006，13（6）：823-835.

［11］ baselga j，arteaga cl. critical update and emerging trends in epidermal growth factor receptor targeting in cancer［j］. j clin oncol，2005，23（11）：2445-2459.

［12］ gothy dc，fawcett s，walsh d，et al. alternatively spliced variants of cell adhesion molecule cd44 and tumor progression in colorectal cancer［j］. br j cancer，1996，74（3）：342-351.

［13］ gunthert u，hofmann m，rudy w，et al. a new variant of glycoprotein cd44 confers metastatic potential to rat carcinoma cells［j］. cell，1991，65（1）：13-24.

［14］ seiter s，arch r，reber s，et al. prevention of tumor metastasis formation by antivariant cd44［j］. j exp med，1993，177（2）：443-455.

［15］ vizoso fj，fernandez jc，corte md，et al. expression and clinical significance of cd44v5 and cd44v6 in resectable colorectal cancer［j］. j cancer res clin oncol,2004，130（11）：679-686.

［16］ arao j，fukui h，ono y，et al. immunohistochemical localization of cathepsin d in colorectal tumors［j］. dis colon rectum，2000，43（3）：396-401.

［17］ suzuki e，ota t，tsukuda k，et al.nm23-h1 reduces in vitro cell migration and the liver metastatic potential of colon cancer cells by regulating myosin light chain phosphorylation［j］. int j cancer，2004，108（2）：207-211.

［18］ dursun a，akyurek n，gunel n，et al. prognostic implication of nm23-h1 expression in colorectal carcinomas［j］. pathology，2002，34（5）：427-432.

［19］ dusonchet l，corsale s，migliavacca，et al. nm23-h1 expression does not predict clinical survival in colorectal cancer patients［j］. oncol rep，2003，10（5）：1257-1263.