作者：赵建华， 宋擎， 汪素芳， 苏强， 张立伟

【摘要】   　　目的考察糖类、氨基酸及黄酮类物质对茴香醛-硫酸法测定芦笋总皂苷含量时的影响，并确定该法的最佳比色条件。方法选用菝葜皂苷元为对照品，采用茴香醛-硫酸法，在429 nm处测定糖类、氨基酸及黄酮类物质的吸光度，并利用正交实验设计优化比色条件。结果在429 nm处3类物质除黄酮类有较小的末端吸收外均无明显吸收，干扰较小。最优比色条件为样品挥干，加入1%茴香醛无水乙醇溶液0.2 ml，100℃水浴30 min，冷却后测定。结论该法操作简便，干扰小，比色条件 经济 ，可靠，便于实际应用。

【关键词】   芦笋边角料 总皂苷 茴香醛-硫酸法 干扰因素考察 比色条件优化

    芦笋asparagus officinalis linn.，学名石刁柏，为百合科天门冬属多年生草本植物，是一种药食两用的植物，其根茎入药，性苦，微辛，微温，功能温肺下气［1，2］。成分分析表明，芦笋中含有游离氨基酸、维生素、微量元素硒等多种营养成分，以及甾体皂苷、多糖、黄酮类等药用成分［3］，具有极高的药用价值。Www.11665.cOm 现代 药 理学 研究表明：芦笋提取物对多种癌细胞均有抑制作用，具有降血脂、提高人体免疫功能、抗衰老等功能，其中，甾体皂苷为重要的物质基础［4］。国内外 文献 报道，芦笋中含有多种甾体化合物，已分离得到19种甾体皂苷［5～7］，结构分析表明，芦笋皂苷多为螺甾皂苷，其苷元多为菝葜皂苷元［4］。

    目前，植物总皂苷的含量测定主要为比色法，选用不同的显色体系，常见有乙酸酐-浓硫酸法、高氯酸法、浓硫酸法、香草醛-高氯酸法、香草醛-硫酸法、对二甲氨基苯甲醛法及茴香醛-硫酸法等7种。我们前期研究发现［8］，针对芦笋总皂苷的测定，综合考虑各因素的影响，茴香醛-硫酸法优于其它6种方法。本文基于茴香醛-硫酸试剂与螺甾皂苷的专属性反应，以菝葜皂苷元为对照品，考察了芦笋中几种常见物质：糖类(葡萄糖、蔗醣、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖)，氨基酸(半胱氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、赖氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、缬氨酸、异亮氨酸)及黄酮类(槲皮素、芦丁)对茴香醛-硫酸比色法［9］测定芦笋总皂苷含量的影响，并利用正交实验法优化了茴香醛-硫酸比色法的最佳比色条件，以期为进一步精确测定芦笋总皂苷含量奠定基础。

　 　1  仪器与材料

　　1.1  仪器 hp 8453uv-vis 吸收光谱仪（美国惠普公司）；unico 7200型可见分光光度计［尤尼柯（上海）仪器有限公司］；bs110s 电子 天平（北京塞多斯天平有限公司）。

　　1.2  材料茴香醛（cp，天津市光复精细化工研究所）；菝葜皂苷元（ 中国 药品生物制品检定所，批号110744－200508）；芦笋总皂苷（本室自制）；槲皮素(中国药品生物制品检定所，批号 200406)；芦丁(中国药品生物制品检定所，批号 020620)；所用单糖、双糖、氨基酸及其余化学试剂均为国产分析纯试剂。

　　 2  方法与结果

　　2.1  茴香醛-硫酸法的干扰因素考察

　　2.1.1  对照品溶液的制备

　　精密称取菝葜皂苷元5 mg，置于10 ml容量瓶中，用甲醇溶解，定容，吸取1 ml溶液稀释至10 ml，即得。

　　2.1.2  样品溶液的制备依次精密称取芦笋总皂苷、各种糖类、氨基酸、黄酮各5 mg，分别置于10 ml容量瓶中，用甲醇溶解，定容，即得。

　　2.1.3  显色溶液的制备吸取8 ml无水乙醇于10 ml容量瓶中，加入1 ml浓硫酸，摇匀，冷却至室温，加入50 μl茴香醛，无水乙醇定容，摇匀，即得。

　　2.1.4  测定方法分别精密吸取“2.1.2”项下各溶液1 ml，挥干溶剂，加入新鲜配制的0.5％茴香醛-浓硫酸乙醇液0.5 ml，100℃水浴15 min，取出冷却，加入无水乙醇5.0 ml，茴香醛-浓硫酸乙醇液做空白，于350～800 nm波长进行扫描，比较3类物质对测定方法的影响。

    测定结果显示，在429 nm（±1nm）附近菝葜皂苷元和总皂苷均有明显吸收峰，糖类在此处均无明显吸收（图1），说明糖类对茴香醛-浓硫酸法干扰很小；在同等条件下，15种氨基酸在429 nm（±1 nm）附近也均无明显吸收（图1），且曲线均在基线附近，说明氨基酸对茴香醛-硫酸法基本没有影响。图2显示，两种黄酮在429 nm（±1 nm）附近均有吸收峰末端，但吸收不是很大，说明黄酮类物质对茴香醛-硫酸法有一定的影响。

　　2.2  茴香醛-硫酸法比色条件的优化

　　2.2.1  正交实验法优选茴香醛-硫酸法比色条件设计l9（34）正交表对显色剂浓度、反应时间、反应温度、显色剂体积4因素进行考察。水平因素见表1，测定结果及极差分析见表2，方差分析及最小二乘法分析结果见表3～4。表1  正交实验因素水平表（略）表2  正交实验测定结果及极差分析结果（略）表3  正交实验结果方差分析表（略）表4  各因素水平最小二乘法平均值（略）
　
    从分析结果的r值得出，4因素对测定结果的影响顺序为反应温度＞显色剂体积＞反应时间＞显色剂浓度，最优显色条件为a3b2c3d1，即5%茴香醛无水乙醇液，吸取0.2 ml，100℃水浴30 min。

　　查f值分布表可知，f0.05(2,2)=19.0，f0.01(2,2)=99.0，根据方差检验判断标准，当f值大于f0.05小于等于f0.01时，该因素作用显著，记为“*”。从表3得知，4个因素的f值均大于f0.05(2,2)小于f0.01(2,2)，因此判定4个因素对实验影响均较为显著，根据f值大小排序，可以看到4个因素的影响次序为反应温度＞显色剂体积＞反应时间＞显色剂浓度，其结果与极差分析结果相吻合。

　　由表4中看到，取各因素最小二乘法平均值中的最大值，得到条件为显色剂浓度5%，反应时间30 min，反应温度100℃，显色剂用量0.2 ml，其结果与极差分析结果吻合。

    在实验过程中发现数据中5%茴香醛乙醇溶液与1%两个浓度的差别很小，且5%对茴香醛用量较大，如果用1%浓度代替5%浓度，会大大节省显色剂用量，因此在进行最优工艺验证时，同时对1%浓度条件进行了平行实验，以观察两种浓度的差异。

　　2.2.2  最优比色条件验证精密吸取“2.1.1”项下菝葜皂苷元溶液1 ml共10份，分别置于10支具塞试管中，挥干溶剂，试管从1～10标号，其中1～5号试管加入5%茴香醛乙醇溶液0.2 ml，6～10号试管中加入1%茴香醛溶液0.2 ml，100℃水浴30 min，取出冷却，于429 nm下测定吸光度。结果见表5。表5  最优比色条件验证结果（略）

    对上表两组数据进行双样本t检验，结果p=0.118>0.05，表明两组实验方差是一致的，两种浓度之间无显著差异。从测得的吸光度来看，两种浓度显色剂的吸光度值均超过了正交实验数据，符合正交实验结果。因此将显色剂浓度换为1%茴香醛乙醇是可行的。这也从另一角度说明1%的浓度已基本能够反应完全，而过量的茴香醛反而造成不必要的浪费。
　
    综上所述，最后确定茴香醛-浓硫酸法显色条件为1%茴香醛无水乙醇溶液，吸取0.2 ml，100℃水浴30 min。

　 　3  结论

    考察了糖类、氨基酸及黄酮类对茴香醛-硫酸法测定芦笋边角料中总皂苷含量时的干扰［10］，在429 nm处菝葜皂苷元与芦笋总皂苷均有明显的吸收，而糖类和氨基酸几乎没有吸收，黄酮类有较小的末端吸收。结果说明，糖类和氨基酸对本法的干扰较小，黄酮类有一定干扰，为了准确测定芦笋中总皂苷含量，测定时可以考虑用差示分光光度法来扣除类黄酮物质的干扰。其余6种常见比色法的同步研究结果表明［8］，糖类对乙酸酐浓硫酸法、浓硫酸法及香草醛-高氯酸法影响较大、而3类物质对高氯酸法、香草醛-硫酸法及对二甲氨基苯甲醛法均影响较大，干扰明显。因此，茴香醛-浓硫酸法对总皂苷测定专属性要强于其余6种方法，另外，茴香醛法中，菝葜皂苷元与总皂苷在测定波长429 nm处呈现明确的吸收峰，响应明显，通过数次重复实验，此吸收峰较为稳定，优于其余方法。

    正交实验及极差分析表明，4因素对测定结果的影响顺序为反应温度＞显色剂体积＞反应时间＞显色剂浓度，方差分析及最小二乘法分析均与上述结果吻合，最优比色条件为a3b2c3d1，即5%茴香醛无水乙醇液，吸取0.2 ml，100℃水浴30 min。说明分析结果准确可靠。

    验证实验得出，用1%茴香醛无水乙醇溶液代替5%的浓度所得数据符合正交实验结果，不仅可以满足实验要求，而且能大大节省显色剂用量，避免不必要的浪费，因此最佳比色条件为：样品挥干，加入1%茴香醛无水乙醇溶液0.2 ml，100℃水浴30 min，冷却后测定。本法操作简便， 经济 可靠，便于实际应用。

【 参考 文献 】
  　　［1］郜凤香，范镇远，王 伟,等.芦笋药理及应用研究［j］.食品研究与开发，1999,20（6）：19.

　　［2］熊光权，周 明，叶丽秀,等.芦笋贮藏过程中功能成分的变化研究［j］.食品 科学 ，2005，26（9）：537.

　　［3］周利亘，王春辉，王君虹,等.芦笋活性成分及其生物学功能［j］.安徽农学通报，2006，12（2）：23.

　　［4］孙春艳，赵伯涛，郁志方,等.芦笋化学成分及药理作用研究进展［j］.