作者：林兴， 黄权芳， 张士军， 刘曦， 黄仁彬

【摘要】  目的观察六月青总皂苷（the terpenoids of liuyueqing，tlyq）体外抗乙型肝炎病毒（hbv）的作用。方法采用血清药理学方法，在hbv的体外细胞培养系统中（2.2.15细胞）进行tlyq抗hbv作用观察。结果tlyq含药血清在hepg2.2.15细胞培养中可有效地抑制细胞hbv dna的复制，其作用呈明显的量效和时效反应关系。结论tlyq在体外能明显抑制hbv，是六月青主要活性成分之一。

【关键词】  六月青总皂苷； 乙型肝炎病毒； hepg2.2.15细胞

　　abstract：objectiveto study anti-hbv activity of  the terpenoids of liuyueqing (tlyq) in vitro.methodsthe hbv in vitro cell culture system (hepg2.2.15 cell) was used for examining the anti-hbv activity of tlyq with serum-pharmacology. resultsthe serum containing tlyq could decrease the hbv dna level in hepg2.2.15 cell, and its inhibitory effects were dose-and time-dependent.conclusiontlyq can inhibit hbv dna in vitro significantly , and it maybe one of the main active components of liuyueqing.

　　key words：the terpenoids of liuyueqing（tlyq）；  hbv ；  hepg2.2.15 cell
   
　　六月青（liuyueqing，tlyq）系爵床科（acanthaceae）植物肖鸡笼（顶花马兰）taraphochlamys affinis (griff) bremekhu ［strobilanthes affinis (griff) y.c.tang］的干燥地上部分［1］。www.11665.com六月青是复方六月雪（clyx）主要成分之一，本课题组前期研究表明，clyx具有明显地抗hbv［2，3］和改善急性化学性肝损伤的作用［4］。本研究以转染有hbv dna的hepg2.2.15为模型，采用中药血清药理学方法，观察tlyq对hbv复制的影响，并初步探讨其作用机制，为筛选出六月青中抗hbv主要活性部位提供实验依据。

　　1  材料与仪器

　　1.1  药物六月青总皂苷，由广西医科大学药理学教研室和广西医学科学实验中心自行提取。

　　1.2  动物wistar大鼠，雌雄各半，体质量（250±10）g，由广西医科大学实验动物中心提供。

　　1.3  细胞株hepg2.2.15细胞株，购自北京医科大学第一附属医院病毒研究所，本室自行传代，定期用g418筛选。

　　1.4  试剂阿昔洛韦（aciclovir　acv）：湖南迪诺制药有限公司医药工业研究所产品，批号: 20070518；rpmi1640培养基：美国gibco公司，cat№21202-016；胎牛血清：美国gibco公司，cat№21607-042；g418：美国sigma公司，cat№228527-72；hbv dna荧光定量pcr试剂盒：深圳匹基生物工程股份有限公司，批号：20070613。

　　1.5  仪器icycler fq实时荧光定量pcr仪：美国bio-rad公司；co2孵箱：美国thermo　forma公司，model311。

　　2  方法

　　2.1  六月青总皂苷的制备六月青粗粉1.0 kg，加10倍量80%乙醇回流提取3次，1.5 h/次，减压回收乙醇至无醇味，分别用石油醚、氯仿、醋酸乙酯萃取，弃去有机溶剂萃取液，最后再用水饱和正丁醇萃取，取正丁醇萃取液减压浓缩至干，得到41.28 g浸膏，上处理好的ab-8型大孔树脂柱（40 mm×800 mm），分别用6bv的30%乙醇和50%乙醇洗脱，收集醇洗脱液，减压回收乙醇， 60℃的减压恒温干燥箱中干燥得4.28 g淡黄色化合物，经常规化学定性试验证实为皂苷类，利用香草醛-硫酸分光光度法测定总皂苷含量［5］，纯度为85.8%。

　　2.2  tlyq含药血清的制备3月龄wistar大鼠50只，随机分为5组，每组10只。①空白对照组：予等量的生理盐水；②阳性对照组：acv 0.1×10-3 g·kg-1·d-1；③tlyqh组：28.2×10-3 g·kg-1·d-1（相当于生药6.6 g. kg-1·d-1）；④tlyqm组：14.1×10-3 g·kg-1·d-1（相当于生药3.3 g·kg-1·d-1）；⑤tlyql组：7.1×10-3 g·kg-1·d-1（相当于生药1.7 g·kg-1·d-1）。各组动物在同样条件下饲养，均以2次/d，早晚各1次空腹灌胃，连续给药7  d。于末次灌胃（灌胃前禁食不禁水12 h）后2 h，乙醚吸入麻醉，腹主动脉抽血，低速离心分离血清，并将每组动物的血清混合。经56℃ 30 min灭活处理，经0.45 μm的微孔滤膜，再经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后，置-20℃冰箱保存备用。

　　2.3  荧光定量pcr（fq-pcr）法检测hbv dna取hepg 2.2.15细胞1瓶，用胰酶消化后制备成单细胞悬液，计数后调整细胞浓度至2×104 cell·ml-1，加入24孔细胞培养板，每孔900 μl，置co2孵箱（37℃，5%co2）中培养24 h后，分别加入各组含药血清100 μl，每个浓度3个复孔。以等量的完全培养液为空白对照。连续培养72 h后，分别吸出上清液于1.5 ml灭菌eppendor管中， -20℃保存，统一待检。再次加入上述含药血清的培养液继续培养72 h后，分别吸出上清液于1.5 ml灭菌eppendorf管中， -20℃保存，统一待检。    按试剂盒方法提取样品hbv dna。hbv dna定量标准品由深圳匹某公司直接提供。各反应管放入fq-pcr仪，按以下条件进行扩增：94℃预变性1 min，95℃变性5 s，60℃退火、延伸20 s。共反应42个循环。扩增过程及荧光信号检查、数据的储存和分析均由仪器及其自带的软件自动完成。

　　2.4  统计学处理采用spss10.0统计软件分析数据，组间比较采用方差分析，各均数两两比较。

　　3  结果
   
　　与空白对照组比较，tlyq中、高剂量含药血清作用72，144 h后，hepg2.2.15细胞上清液中hbv dna的拷贝数明显降低（p<0.05或p<0.01），提示对hbv dna具有显著的抑制作用，并且随着药物浓度和作用时间的增加，其抑制作用逐渐增强，呈现一个明显的量效和时效反应关系。结果见表1。表1  tylq含药血清对hepg2.2.15细胞hbv dna的抑制作用（略）

　　4  讨论
   
　　复方六月雪（clyx）是通过长时期的民间临床观察而拟定的治疗急慢性乙型肝炎和肝硬化的验方，主要由广西民间草药六月青、白花蛇舌草、栀子花根等组成，本课题组前期大量的实验研究表明，该方可有效地抑制鸭乙型肝炎病毒dna 和hepg2.2.15细胞hbv dna的复制［2，6，8］；无毒浓度的clyx在hepg2.2.15细胞培养中可有效地抑制细胞hbv dna的复制及hbsag（乙型肝炎表面抗原）和hbeag（乙型肝炎e抗原）的分泌［3，7］；此外，clyx对ccl4、ap、d-gal所致小鼠急性化学性肝损伤均有明显的保护作用，并由此推测其保肝作用可能与诱导肝药酶有关［4］。
   
　　中药复方成分非常复杂，其组方配伍多数是以某一味药为主其余为辅，诸药发挥协同治疗作用。为了能更好地保证clyx疗效稳定性，本研究对该方中的君药（六月青）进行研究，即从六月青提取分离出总皂苷活性部位，并对其进行抗hbv药效学研究，筛选出该方有效活性部位，进而为下一步分离纯化有效化学成分，建立处方质控标准提供实验依据。本实验结果表明，tlyq中、高剂量含药血清作用72，144 h后，hepg2.2.15细胞上清液中hbv dna的拷贝数明显降低（与空白对照组比较，p<0.05或p<0.01），提示对hbv dna具有明显的抑制作用，并且随着药物浓度和作用时间的增加，其抑制作用逐渐增强，呈现一个明显的量效和时效反应关系，鉴于此，认为总皂苷应是六月青主要活性部位之一。

【参考文献】
  　［1］林 兴，黄权芳，李 江，等.　 广西民间药六月青的性状与显微鉴定［j］.中药材，2005，28（7）：541.

　　［2］张士军，林 军，蒋伟哲. 等，复方六月雪对鸭乙型肝炎病毒dna的抑制作用［j］.中药材，2007，30（2）：191.

　　［3］杨霞芳，张士军，黄春喜. 等，复方六月雪体外抗hbv的实验研究［j］.内科，2007，2（3）：317.

　　［4］苏洁寒，荣延平，蒋伟哲. 等，复方六月雪对急性化学性肝损伤的保护作用［j］.广西医科大学学报，2003，20（4）：497.

　　［5］边永玲，李焕芬，张 颖，等.　葛花总皂苷的提取及总皂苷和总黄酮的含量测定［j］.四川中医，2008，26（7）：41.

　　［6］张士军,焦 杨,林 兴,等.　 复方六月雪对hepg2. 2. 15细胞hbv dna的抑制作用［j］.中药药理与临床，2007，23(1)：59.

　　［7］张士军,黄春喜,谢海源,等.　复方六月雪对hepg2.2.15细胞hbsag和hbeag的抑制作用［j］.中国医院药学杂志，2007，27（6）：715.

　　［8］张士军,林 军,焦 杨,等.　复方六月雪含药血清对hepg2.2.15细胞hbv dna的抑制作用［j］.中药材，2006，29（12）：1338.