作者：金星林，崔刚，千昌石，杜希臣，吴艳玲  

【摘要】  目的动态检测虎眼万年青总皂苷对二乙基亚硝胺诱发的大鼠肝癌变过程中肝组织中igf-2及p16ink4a表达的影响。方法二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌变，虎眼万年青总皂苷干预，运用实时定量pcr法检测并分析第14周末预防组、模型组及18周末治疗组癌旁组织、癌组织、模型组癌组织标本中igf-2及p16ink4a的表达。结果肝癌变模型组18周癌组织中igf-2表达最高，与正常组、14周末预防组、模型组、18周末治疗组癌旁组织及癌组织间比较均有统计学意义（p<0.05）。肝癌变模型组18周癌组织中p16ink4a表达最高，与正常组、14周末预防组、模型组、18周末治疗组癌旁组织间比较均有统计学意义（p<0.05）。治疗组癌组织与模型组18周癌组织间无统计学差异（p>0.05）。结论二乙基亚硝胺诱发的肝癌组织中igf-2及p16ink4a表达水平增高，而虎眼万年青总皂苷具有干预肝癌组织中igf-2、p16ink4a表达水平。

【关键词】  虎眼万年青总皂苷； 二乙基亚硝胺； 肝； 实验； igf-2； p16ink4a

          二乙基亚硝胺所诱导大鼠肝癌表达众多基因中，以胰岛素样生长因子2(igf-2)、p75ntr关联细胞死亡执行子ade、细胞周期依赖性激酶抑制基因(pl6ink4a)与肿瘤的关系尤为突出［1］。www.11665.COm虎眼万年青ornithogalum caudatum ait为百合科多年生球根植物，民间全草入药，用于抗炎症、抗肿瘤等治疗。虎眼万年青皂苷（osw-1）抗p338淋巴细胞白血病活性，是常见抗癌药物喜树碱、阿霉素、紫杉醇抗癌活性的10～100倍［2］。由于osw-1提取、合成工艺复杂且较昂贵，给广泛的实验、应用研究工作带来一定困难。为了进一步开发和利用虎眼万年青植物，本实验应用虎眼万年青总皂苷检测对二乙基亚硝胺诱发的大鼠肝癌变过程中肝组织中igf-2 和p16ink4a表达水平的影响。

　　1  材料

　　1.1   药物提取

　　取植物虎眼万年青，在自然条件下干燥，粉碎成粉。加入95%的乙醇浸泡24 h，纱布、滤纸过滤后，收集滤液，滤渣继续加入乙醇浸泡，同上方法循环 3次，收集滤液，将3次所得滤液合并。滤液经减压浓缩为原来体积的1/5，再用1/3体积的石油醚萃取脱脂，保留水相，再次减压蒸馏后，加水稀释上ab-8柱吸附，反复吸附3次，6～8倍柱体积水洗掉糖后用5倍柱体积95％乙醇洗脱皂苷。所得皂苷洗脱液，经d-280柱脱色后，减压浓缩后蒸干，即为虎眼万年青总皂苷。

　　1.2  实验动物及设计

　　雄性wistar清洁级大鼠30只，体质量130～150 g，购自延边大学医学部实验动物中心。动物适应3 d后开始实验。正常组：整个实验过程中均饮用灭菌自来水及基础饲料，并于18周末宰杀6只。模型组：每日给予基础饲料同时，用灭菌自来水配制浓度为95 μg/ml的二乙基亚硝胺(den)溶液（美国sigma公司，避光保存，新鲜配制)，供大鼠自由饮用，每天更换1次。连续饮用4周后，改饮一般的灭菌自来水4周，再继续饮含95 μg/ml的den溶液。并分别于饲养第14周末、18周末分别宰杀各6只。肝硬化预防组：于实验开始在肝癌模型建立的同时, 根据预实验小鼠虎眼万年青总皂苷的ld50为3.2g/kg, 以接近于ld50之1/30的剂量，即相当于100mg/kg的给药浓度，以蒸馏水制成所需浓度的混悬液,每日灌胃并于14周末宰杀6只。肝癌治疗组：第14周后从模型组中随机选出6只，按模型组饲养同时给予虎眼万年青总皂苷100mg/kg，并于第18周末宰杀。

　　1.3  取材及处理

　　各组大鼠宰杀前禁食12h，称体质量,乙醚麻醉后, 解剖腹腔，取肝组织，出现癌灶者取肉眼癌结节及距癌灶边缘0.5～1cm癌旁组织约50～100mg样品,生理盐水冲洗,液氮快速冷冻,并置-70℃冰箱,待统一检测。

　　1.4  试剂及器材

　　trizol试剂、无rna酶的水、无rna酶的糖原（invitrogen life technologies）；氯仿、异丙醇、100%乙醇、乙酸钠、甲醛（上海化学试剂有限公司）；tris-hcl、edta 、mops、溴化乙锭、2.5 mm dntp混合液、100 bp dna ladder（华美生物工程公司）；rna酶抑制剂；mmlv反转录酶；5xrt缓冲液（上海生工生物工程有限公司）。dk-8d型电热恒温水槽（上海森信实验仪器有限公司）；gene amp pcr system 9700（applied biosystems）；ferotec gradien pcr基因扩增仪（杭州大和热磁电子有限公司）；dyy-8型稳压稳流电泳仪（上海琪特分析仪器有限公司）；h6-1微型电泳槽（上海精益有机玻璃制品仪器厂）；abi 7700 realtime pcr仪（abi）；引物设计软件：primer 5.0。

　　1.5  统计学方法

　　全部数据采用 spss14 for windows统计分析软件进行处理，进行t检验、方差分析。

　　2 方法

　　2.1  样品的rna抽提

　　①每50～100 mg组织样品，加入1 ml的trizol试剂，用电动匀浆器进行匀浆。②匀浆后样品于15～30℃孵育5 min。每1 ml的trizol试剂匀浆的样品中加入0.2 ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15 s后，15到30℃孵育2～3 min。4℃下12 000 r·min-1离心15 min。③将水相转移到新离心管中。水相与异丙醇混合以沉淀其中的rna，加入异丙醇的量为每个样品匀浆时加入1 ml trizol试剂的此时加0.5 ml的异丙醇。混匀后15到30°c孵育10 min后，于4℃12 000 r·min-1离心10 min。④移去上清液，每毫升trizol试剂匀浆的样品中加入至少1 ml的75%乙醇，清洗rna沉淀。振荡后，4℃ 7 500 r·min-1离心5 min。⑤去除乙醇溶液，空气中干燥rna沉淀5～10 min，先加入无rna酶的水用枪反复吹打几次，然后55到60℃孵育10 min。获得的rna溶液保存于-70℃。

　　2．2   使用样品的rna进行cdna合成

　　2.2.1  配制退火混合物rna 2 μg，0.5 μg/μl oligo（dt）18 1μl，加无rna酶的h2o至总体积 10 μl混合液在70℃水浴3 min,降到37℃放置10 min。

　　2.2.2  rt反应液（5xrt缓冲液4μl，2.5mmol/l dntp混合液4μl，rna酶抑制剂1 μl，mmlv反转录酶1 μl，混合后37℃恒温1 min）。

　　2.2.3  加10 μl的rt反应液到10 μl退火混合物中，37℃水浴60 min，加热到95℃维持5 min。得rt终溶液即cdna溶液，置冰浴待用。

　　2.3  合成的cdna用于实时定量pcr

　　2.3.1   制备用于绘制标准曲线的梯度稀释dna模板

    针对每一需要测量的基因和管家基因，选择一确定表达该基因的cdna模板进行pcr反应：dntp（2.5 mmol/l each）（2.5 μl）；10 × pcr缓冲液（2.5 μl）；mgcl2 溶液（1.5 μl）；taq聚合酶（1u）；10 μmol的pcr特异引物f（1 μl）；10 μmol的pcr特异引物r（1 μl）；cdna（1 μl）；加水至总体积为25 μl。轻弹管底将溶液混合，40个pcr循环（94℃，20 s；退火温度，20 s；72℃，30 s）；72℃延伸5 min。
   
　　将pcr产物进行10倍梯度稀释：设定standard1的浓度为106，standard 2的浓度为105 ，standard 3的浓度为104，standard 4的浓度为103，standard 5的浓度为102，standard 6的浓度为10，standard 7的浓度为1。见图1。
  
　　2.3.2  进行realtime pcr反应
   
　　几个梯度稀释的dna模板以及所有cdna样品分别配置realtime pcr反应体系。体系配置如下：dntp（2.5mm each）（2.5μl）；10x pcr缓冲液（2.5 μl）mgcl2 溶液（1.5 μl）；taq聚合酶（1units）；sybergreen（终浓度0.25×）；50x  rox（0.5 μl）；10 μmol/l的pcr特异引物f（1μl）；10 μmol/l的pcr特异引物r（1 μl）；cdna or dna（1 μl）；加水至总体积为25 μl。轻弹管底将溶液混合，5000 r/min短暂离心。
   
　　步骤1配置的pcr反应溶液置于realtime pcr仪上进行pcr反应。
   
　　beta-actin（双向引物序列f:5'cctctatgccaacacagtgc3' r:5'gtactcctgcttgctgatcc3' 退火温度(℃) 59产物长度(bp) 211）： 95℃，3 min；40个pcr循环［95℃，15 s；59℃，20 s；72℃，20 s；83℃（收集荧光），15 s］。为了建立pcr产物的熔解曲线，扩增反应结束后，95℃，2 min；61℃，20 s；72℃，20 s；99℃，10 s，并从72℃缓慢加热到99℃（8 min）。见图2。
   
    igf-2［双向引物序列: f5'gccatttggaacattggacag 3'  r:5'tcccacgaggcatattaacact 3'退火温度(℃)60产物长度(bp)149］： 95℃，3 min；40个pcr循环［95℃，15 s；60℃，20 s；72℃，20 s；79℃（收集荧光），15 s］。为了建立pcr产物的熔解曲线，扩增反应结束后，95℃，2 min；61℃，20 s；72℃，20 s；99℃，10 s，并从72℃缓慢加热到99℃（8 min）。见图3。
   
    p16ink4a（双向引物序列f:5'accaaacgccccgaaca 3'r:5'gagagctgccactttgacgt3'退火温度(℃)60，产物长度(bp)76）： 95℃，3min；40个pcr循环［95℃，15 s；60℃，20 s；72℃，20 s；80℃（收集荧光），15 s］。为了建立pcr产物的熔解曲线，扩增反应结束后，95℃，2 min；62℃，20 s；72℃，20 s；99℃，10 s，并从72℃缓慢加热到99℃（8 min）。见图4。
  
　　3  结果

    各样品的目的基因和管家基因分别进行realtime pcr反应。根据绘制的梯度稀释dna标准曲线，各样品目的基因和管家基因的浓度结果直接由机器生成。每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度，即为此样品此基因的校正后的相对含量。实时定量pcr时各样品加样量均为1 μl，然而由于受rna浓度定量误差和rna逆转录效率误差等的影响，每个样品的1 μl体积的cdna其含量并不完全相同，为校正此差异，使用管家基因beta-actin作为内参，以样品待测基因得值除以此样品内参值，最终得到的比值为样品的待测基因相对含量。见表1。表1  各组肝组织校正后1 μl中igf-2及p16ink4a含量（略）
   
　　在igf-2中，与模型组18周癌组织比较，*p<0.05；在p16ink4a中，与模型组18周癌组织比较，*p<0.05；而与治疗组癌组织比较p>0.05；治疗组癌组织与模型组18周癌组织间亦p>0.05

　　4 讨论
   
　　肝癌是由病毒、化学致癌物等多病因作用［3］，因癌基因或癌相关基因激活、抗癌基因失活或胚胎期某些酶基因重新复活等诸多因素引起肝细胞生长失控而致癌变，经启动、促进、演变多阶段的发病过程，其中基因的调控和表达、多种生长因子的活性等均与肝癌的发生、发展密切相关［4］。
   
　　igf-2在胎肝和新生儿肝脏中有大量表达，但出生后基因迅速降低直至关闭，肝细胞癌变igf-2呈胚胎性过量表达，并具有强烈的致有丝分裂剂作用，参与肿瘤细胞增生及分化［5］。igf-2为肝癌的一种缺氧诱导血管生成因子，肝硬变再生结节和肝癌细胞的快速分裂导致肝脏供血不足，造成局部缺氧状态，促使igf-2合成增加，并作为血管活性因子，间接促进血管内皮生长因子的合成，刺激肝癌新生血管的形成；igf-2在肝细胞癌变发生、发展中具有重要作用，可能为诱癌因素导致igf-2基因异常激活和过量表达，促使具有高增殖活性状态的癌前肝细胞转化，最终导致肝癌发生［6］。
   
　　本研究以实时定量pcr法定量分析了二乙基亚硝胺诱发肝癌变过程igf-2的表达与变化。结果显示癌变过程中肝组织中igf-2含量逐渐增加，肝癌进展阶段肝癌组织中igf-2表达水平明显增高，说明肝癌细胞的快速分裂导致肝脏供血不足，igf-2表达水平急剧升高。虎眼万年青总皂苷在肝癌变前期对igf-2表达水平作用不大，而至肝癌进展阶段，经虎眼万年青总皂苷干预的肝癌组织的igf-2表达量明显低于模型组，说明虎眼万年青总皂苷抑制肝癌细胞的快速分裂。而虎眼万年青总皂苷干预的肝癌组织igf-2表达水平高于癌旁组织，但无统计学意义，能否说明igf-2主要是通过肝细胞癌自分泌方式表达其水平，有待进一步深入研究。
   
　　p16ink4a基因是直接作用于细胞周期、抑制细胞分裂的抑癌基因，属细胞周期依赖性激酶抑制因子(cdki)基因家族，所编码的p16蛋白可直接与cdk4结合，抑制cdk4-cyclin d复合体的催化活性,抑制结合成全酶磷酸化rb蛋白，从而发挥细胞分裂周期的负性调控作用［7］,使细胞停滞于g1/s转换点。人原发性肝癌存在高频率的p16ink4a基因5 cpg岛甲基化所致的p16基因失活，而这个基因缺失和突变的频率比较低［8］。外源性p16基因对 rb-的smmc7721的生长无抑制作用，p16ink4a对肝癌细胞生长抑制的作用可能依赖于rb途径的完整性；rb可通过对p16ink4a 基因启动子的负调节作用抑制其蛋白表达，在功能性rb缺如的细胞中p16ink4a 蛋白表达水平升高［9］。

    本研究以二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌，实时定量pcr检测肝癌变中肝组织、肝癌组织及癌旁组织的p16ink4a表达水平，结果显示肝癌组织中p16ink4a表达量显著高于肝癌前病变的肝组织及肝癌旁组织的表达水平。虎眼万年青总皂苷作用组并不改变肝癌前病变期p16ink4a的水平，但肝癌发生进展阶段，提高p16ink4a表达水平。能否说明虎眼万年青总皂苷能够提高抑癌基因p16ink4a表达水平，抑制cdk4-cyclin d复合体的催化活性，抑制结合成全酶磷酸化rb蛋白，待进一步深入研究。

【参考文献】
  1］阚卫兵，方肇勤，管冬元，等.乙基亚硝胺所诱导大鼠肝癌表达上调的基因［j］. 世界华人消化杂志， 2005，13(20)：2420.

　　［2］mimaki y,kuroda m,kameyama a,et a1.cholestane glycosides with potent cytostatic activities on various tumor cells from ornithogalum saundersiae bulls［j］.bioorg med chem lett,1997，7(5)：633.

　　［3］ji gz，wang xh，miao l，et al. role of transforming growth factor- beta1-smad signal transduction pathway in patients with hepatocellular carcinoma［j］． world j gastroenterol，2006，12：644.

　　［4］yao df，wu xh，zhu y，etal.quantitative analysis of vascular endothelial growth factor，microvascular density and their clinic0pathologic features in hum an hepatocellular carcinoma［j］．hepatobiliary pancreat dis int ，2005，4：220.

　　［5］dong zz，yao df，yao db，et al．expression and alteration of insulin-like growth factor ii- messenger rna in hepatoma tissues and peripheral blood of patients with hepatocellular carcinoma［j］． world j gastroenterol，2005，11：4655.

　　［6］huynh h，chow pk，ooi ll, et al．a possible role for insulin-like growth factor-binding protein-3 autocrine／paracrine loops in controlling hepato -cellular carcinoma cell proliferation［j］．cell growth differ, 2002，13：115.

　　［7］lea nc, orr sj, stoeber k. et al. commitment point during g0-g1, that controls entry into the cell cycle［j］.mol cell biol, 2003，23(7):2351.

　　［8］刘建余,覃扬,李波，等.人原发性肝癌中p16基因表达及 cpg岛甲基化状态的研究［j］.华西医科大学学报，2002，33：540.

　　［9］覃扬,刘建余,李 波,等. p16ink4a和p15ink4b对人肝癌细胞增殖和凋亡影响的研究［j］. 中华医学遗传学杂志，2004，21（2）：132.