【摘要】 【目的】观察益气活血代表药物人参、三七的提取物在不同比例配伍下对大鼠腹膜间皮细胞(pmcs)增殖的影响。【方法】采用胰蛋白酶消化法分离大鼠pmcs，建立稳定的细胞培养模型，加入含425g/l葡萄糖的腹膜透析液作用3h后，再加入不同比例配伍的人参总皂苷和三七总皂苷，采用四甲基偶氮唑盐(mtt)法检测不同浓度的药物及其配伍对大鼠pmcs增殖的影响。【结果】人参总皂苷和三七总皂苷终浓度为100μg/ml及80μg/ml均能对高糖透析液损伤后的pmcs的增殖产生保护作用(p<001);三七总皂苷与人参总皂苷在浓度比为1∶9以及4∶1时能改善425g/l腹透液作用3h后对细胞产生的增殖抑制(p<001)，且两组的保护效能差异无显著性意义(p>005)。【结论】具有益气活血作用的人参与三七提取物在一定比例配伍后能够对高糖刺激下的大鼠pmcs产生一定的保护作用。
【关键词】 人参总皂苷/药理学;三七总皂苷/药理学;益气活血;细胞增殖;腹膜间皮细胞/病理学;细胞培养; 腹膜透析
腹膜间皮细胞(pmcs)是构成腹膜的主要细胞成分之一，具有重要的生理功能，它在保持腹膜结构的完整性和功能的有效性中起重要作用[1]。然而以高渗透压、低ph值、高葡萄糖浓度、乳酸盐缓冲液为特点的乳酸盐腹膜透析液(pds)长期大量使用对腹膜的结构和功能有损害[2]。动物实验证实腹膜透析液能使pmcs出现细胞病理损害并呈现适应性肥大衰老表型，电镜下表现为细胞间紧密连接消失，pmcs活性降低、增殖能力下降，易于衰老脱落，出现腹膜超滤功能下降乃至超滤失败[3-4]。WWW.11665.com近年来，益气和活血类的中药制剂如人参总皂苷、丹参酮等对pmcs影响的体外实验研究均有报道[5-6]，本研究以培养的大鼠pmcs为观察对象，探讨益气活血代表药物人参、三七的提取物人参总皂苷和三七总皂苷不同比例配伍对高糖刺激下pmcs增殖的影响。现报道如下。
1材料与方法
11动物spf级雄性sd大鼠，体质量(150±20)g，由广州中医药大学实验动物中心提供，许可证号：scxk(粤)20080020，质量检测单位：广州中医药大学实验动物中心。
12药物、试剂及仪器425g/l葡萄糖的腹膜透析液为广州百特医疗有限公司产品，人参总皂苷(ginsenosides，gs)为西安天一生物技术有限公司馈赠，有效成分>950mg/kg，三七总皂苷(panax notoginsenosides，pns)为黑龙江珍宝岛制药有限公司生产的血塞通注射用冻干粉，dmem培养液、25g/l胰蛋白酶、四甲基偶氮唑盐(mtt)、二甲基亚砜(dmso)均为sigma公司产品。抗大鼠细胞角蛋白(cytokeratin)抗原的单克隆抗体为博士德公司产品，sp试剂盒购自广州鼎国公司。将100mggs溶于10μldmso中，再用含体积分数10%小牛血清的dmemf12配制成浓度为200mg/ml药液，超滤除菌，-20℃保存，pns药液的配制同gs。小牛血清为杭州四季青生物工程公司产品，超净工作台(苏州净化设备厂)，倒置相差显微镜(日本nikon公司)，co2恒温培养箱(美国harris公司)，smartspec 3000型酶联免疫检测仪(biorad公司)。
13大鼠pmcs的培养与鉴定大鼠pmcs的培养按文献[7]提供的方法操作，融合后间皮细胞呈铺路石样，传代后用cytokeratin抗原的单克隆抗体采用免疫组化方法鉴定细胞。
14细胞增殖试验取对数生长期细胞，接种于96孔培养板，细胞密度为1×105/ml，每孔100μl含体积分数2%小牛血清的培养液同步培养24h，吸弃上清液，加入425g/l腹透液3h后小心吸弃腹透液，再加入不同体积的人参总皂苷与三七总皂苷，用完全培养液补足每孔终液体量为200μl，并根据工作浓度及每孔的液体总量换算成终浓度，每组设4个复孔。孵育6h后每孔加5g/lmtt20μl，继续孵育4h后吸弃培养液，每孔加入dmso溶液150μl，震荡10min，用酶标仪(波长570nm)测定各孔吸光度(d)值。其中人参总皂苷及三七总皂苷的终浓度由低到高分别为5、10、20、40、60、80、100μg/ml。人参总皂苷与三七总皂苷的配伍实验中设9个不同浓度给药组。
15统计学方法采用spss170统计软件进行统计学处理，组间差异比较采用单因素方差分析，两组间均数比较采用lsdt检验，不满足lsdt检验条件者采用秩和检验，检验水平α=005。
2结果
21腹透液对pmcs细胞形态的影响图1(彩图见第438页)结果显示：正常融合后的间皮细胞呈铺路石样，细胞间连接紧密，融合成片。经425g/l腹透液处理3h后，倒置显微镜下可见大片细胞皱缩脱落，细胞间隙变大，铺路石样结构消失，细胞形态转变为不规则型，核仁与胞浆的界限不清。
22pmcs鉴定结果光镜下观察细胞融合时形成铺路石样外观，为典型的上皮细胞形态学表现。图2(彩图见第438页)结果显示：细胞角蛋白抗体染色在胞浆内呈绿色荧光，说明细胞角蛋白抗原阳性，为间皮细胞所特有，排除了成纤维细胞、内皮细胞和白细胞的可能性，证实其分离培养的细胞是pmcs，细胞纯度达95%以上。
23不同浓度三七总皂苷与人参总皂苷单独作用对pmcs增殖的影响表1结果显示：三七总皂苷80μg/ml组及100μg/ml组的吸光度均较透析液对照组显著升高(p<001)，而2组间比较差异无显著性意义(p>005)，说明三七总皂苷终浓度为80μg/ml及100μg/ml时能对高糖透析液损伤后pmcs的增殖产生保护作用，但不能恢复至正常水平。人参总皂苷40、60、80、100μg/ml组的吸光度均较透析液对照组显著升高(p<001)，其中100μg/ml组较40、60μg/ml组吸光度显著升高(均p<001)，但人参总皂苷100μg/ml组与80μg/ml组比较差异无显著性意义(p>005)，说明人参总皂苷终浓度在40~100μg/ml的区间内均能对高糖透析液损伤后pmcs的增殖产生保护作用，且高浓度(100、80μg/ml)时保护效果较低浓度(40、60μg/ml)效果更佳。各组的保护效能均不能使pmcs的增殖恢复至正常水平。表1不同浓度三七总皂苷与人参总皂苷单独作用对pmcs增殖的影响
24不同浓度人参总皂苷与三七总皂苷配伍对pmcs增殖的影响表2结果显示：给药1组与给药8组的吸光度均较透析液对照组显著升高(p<001)，但2组比较差异无显著性意义(p>005)，说明在三七总皂苷与人参总皂苷配伍比例为1∶9以及4∶1时能对高糖透析液损伤后pmcs的增殖产生保护作用，但保护效能均不能使pmcs的增殖恢复至正常水平。表2不同浓度三七总皂苷与人参总皂苷配伍对pmcs增殖的影响
3讨论
人参与三七的配伍前人多用于虚劳咳嗽、胸痹及各种出血性疾患如衄血、吐血等，如《施今墨对药》中载“人参以补为主，三七以散为要，二药参合，一补一散，相互制约，益气活血，散瘀定痛，止血、止咳甚妙”。本实验以高糖腹膜透析液刺激后的大鼠pmcs为对象，观察人参、三七提取物不同浓度及配伍对高糖刺激下pmcs的影响。
人参总皂苷、三七总皂苷分别为中药人参、三七中提取出的有效成分。人参总皂苷主要包括人参皂苷rg1、rb1、rb2等单体，三七总皂苷除了含人参皂苷rg1、rb1外，尚含人参皂苷re以及三七皂苷r1。人参与三七的皂苷类提取物均具有多种生物学效应，研究表明：人参总皂苷有保护组织与细胞、改善记忆、增强免疫以及抗肿瘤等作用[8-10] ，三七总皂苷有抗纤维化、促进造血细胞生长以及保护平滑肌细胞、神经细胞等作用[11-12]，与传统中医药理论对人参、三七功效的描述基本一致。人参皂苷与三七皂苷在慢性肾脏病的治疗中亦取得了一定疗效，研究[13-15]发现人参皂苷rg1能降低肿瘤坏死因子(tnfα)、单核细胞趋化蛋白1(mcp1)的水平，改善糖尿病肾病大鼠足细胞及肾脏的病理损害，rb1能显著减少单侧输尿管结扎大鼠肾间质的胶原沉积，因此具有一定的肾保护作用;以5/6肾切除大鼠为观察对象，三七皂苷能下调组织基质金属蛋白酶抑制剂(timp2)蛋白表达，增加基质金属蛋白酶(mmp2)活性，抑制层粘连蛋白(fn)、ⅳ型胶原(col ⅳ)在肾组织的表达，减轻细胞外基质(ecm)积聚从而起到减轻肾小球硬化的作用。本实验中人参总皂苷和三七总皂苷包括了人参、三七中主要的有效成分。研究结果显示两者分别在100μg/ml组与80μg/ml组均能发挥对高糖透析液损伤后的腹膜间皮细胞产生最佳的保护作用(p<001)。在进一步进行配伍研究中，三七总皂苷与人参总皂苷在配伍比例为1∶9以及4∶1时能明显改善425g/l透析液作用3h后对细胞产生的增殖抑制(p<001)，其具体机制仍需要进一步研究证实。
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