【摘要】 目的 研究灯盏花素对大鼠脑缺血再灌注引起脑损伤的保护作用，探讨其作用机制。方法 选用40只雄性wistar大鼠，随机分成5组：假手术组、生理盐水组（ir组）、mgso4 治疗 组、灯盏花素治疗组ⅰ和ⅱ（breⅰ、ⅱ组）。结扎中脑动脉，然后再灌注。用tunel法和免疫组化法分别检测脑组织凋亡细胞和fas阳性细胞的变化。结果 ①降低脑组织凋亡细胞：mgso4组、breⅰ、ⅱ组在脑缺血再灌注23 h 后海马区凋亡神经元/海马神经元均较ir组海马区凋亡神经元/海马神经元低，差异有显著性。②降低fas阳性表达细胞数量：mgso4组、breⅰ组和breⅱ组在脑缺血再灌注23 h 后海马区fas表达阳性神经元/海马神经元均较ir组海马区fas表达阳性神经元/海马神经元低，差异有显著性。结论 灯盏花素可显著保护大脑缺血再灌注引起的脑损伤,可能与其抑制fas蛋白的表达有关。其作用优于单用mgso4 。
【关键词】 灯盏花素；脑缺血；再灌注；凋亡细胞；fas蛋白
abstract:objective to study the protective effect and mechanism of breviscapine on rat cerebral damage after ischemiareperfusion. methods 40 male wistar rats were divided into five groups: sham group, ir group, mgso4 treatment group, breviscapine treatment group ⅰ and ⅱ. the brain artery was ligated and then infused. apoptosis of brain cells and changes of fas positive cells was identified by tunel method and immunohistochemical method respectively. results ① apoptosis of neurons cells in brain was reduced: compared with ir group, mgso4 group, bre ⅰ group and bre ⅱ group showed lower hippocampus apoptosis neurons / hippocampal neurons 23 hrs after ischemiareperfusion, and bre group was lower in apoptosis neurons than mgso4 group, the difference was significant. ② the number of fas positive cells in cerebral was reduced: compared with ir group, mgso4 group, bre ⅰ group and bre ⅱ group were lower in hippocampus faspositive neurons / hippocampal neurons 23 hrs after ischemiareperfusion, and bre group was lower than mgso4 group in apoptosis, the difference was significant. conclusion breviscapine could significantly protect the brain from ischemia reperfusion brain injury, what might be related to inhibition of fas protein expression. its effect was better than mgso4.
key words:breviscapine; cerebral ischemia; reperfusion;apoptosis cells;fas protein
脑血管缺血性疾病是高致残率和高死亡率的疾病，神经保护药物将有助于减轻缺血半暗区的损伤，促进脑功能的恢复。www.11665.com灯盏花素(breviscapine，bre)是从中药灯盏花中提取的，其有效成份是4’羟基黄芩素7o葡萄糖醛酸苷［1］，具有显著的抗血小板和血栓形成的活性［2,3］。灯盏花素已被用于治疗缺血性脑血管疾病，通过清除自由基和凋亡细胞而保护大脑。在脑缺血前后应用灯盏花素，研究证实其对缺血再灌注(ischemiareperfusion，ir)有保护作用［4,5］，然而，其治疗机制尚不完全清楚。本文进一步研究灯盏花素(bre) 对大鼠脑缺血再灌注引起脑损伤的保护作用及其可能机制，观察其保护作用是否比mgso4更有效。
1 材料与方法
1.1 材料
40只wistar雄性大鼠，体质量200～250 g，由湖北省实验动物中心提供［许可证编号：scxk（鄂）20040509］。实验室温度保持在（21±2）℃，相对湿度为50%～75%；bre( 中国 云南省玉溪药业有限公司，纯度＞ 95% )溶解于生理盐水，用naoh调整ph至6.5；mgso4(无锡第七制药厂)，用母液治疗，传统常用药物；histostaintmsp kits 和抗fas蛋白抗体为美国santa cruz生物技术产品。
1.2 方法
1.2.1 动物分组
40只wistar大鼠被随机分成5组,每组各8只：①假手术组：仅游离双侧颈总动脉但不予阻断，注射生理盐水20 ml/kg；②ir组(注射生理盐水20 ml/kg)；③bre ⅰ组(bre 50 mg/kg)；④bre ⅱ组(bre 75 mg/kg)；⑤mgso4组（30 mg/kg）。所有药物在缺血10 min 后静脉给药。实验过程中无死亡和脱失。
1.2.2 中脑动脉结扎(mcao) 方法见 文献 ［6］。
1.2.3 原位末端标记（tunel）染色
用tunel方法检测凋亡细胞的dna片段。在荧光显微镜下计数凋亡细胞,观察缺血再灌注2 h，5 h,23 h脑组织凋亡细胞的变化。
1.2.4 免疫化学染色
免疫组织化学抗fas蛋白染色及fas蛋白阳性细胞表达的观察与半定量测定。快速取一部分缺血大脑海马组织，常规经甲醛固定、脱水、包埋、切片(5 μm)，免疫组织化学染色采用链霉素亲生物素－过氧化物酶法(sp法)。经梯度脱蜡、抗原修复(胰酶消化)、漂洗、小牛血清封闭非特异抗原、加一抗、漂洗、加二抗、漂洗、3，3’二氨基联苯胺染色，苏木素染色、脱水、透明、封片等步骤，在光镜下观察，并进行半定量图像分析。20倍物镜下在每张切片梗死灶周边区域即缺血半暗带区取相互不重叠的6个视野，记取其中fas蛋白表达阳性细胞，每只大鼠所有切片上阳性细胞密度(以阳性细胞数/10×20视野表示)的（±s）作为该只动物缺血半暗带区阳性细胞密度代表值，并显微照相。
1.2.5 统计学处理
采用统计学软件包spss 11.5进行统计分析。实验数据用平均数±标准差(±s)表示，用studentnewmankeul 检验后再进行方差分析，以p<0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 bre 对神经元凋亡的影响
在缺血再灌注后3 个不同的时间点，与ir组比较，bre 组和mgso4 组大鼠海马的平均凋亡细胞明显降低。bre 组大鼠海马平均凋亡细胞比ir组和mgso4组显著地减少，差异有显著性。 见表1。表1 脑缺血再灌注2 h、5 h 和23 h后bre对大鼠大脑海马神经元凋亡的影响（略）
2.2 bre 对fas表达的影响
ir组、bre 组和 mgso4 组fas蛋白的阳性表达都增加；bre 组fas蛋白的阳性表达比ir组、mgso4组显著减少，其差异有显著性。见表2。表2 脑缺血再灌注2 h、5 h 和23 h后bre对大鼠大脑海马神经元fas表达的影响（略）
3 讨论
在脑缺血/再灌注损伤后，神经元凋亡显著增加。在脑缺血过程中，缺血半暗带区的多种病理生理过程，包括兴奋性氨基酸毒性、自由基、钙超载、炎症反应及线粒体损伤都可以触发细胞凋亡。脑缺血后细胞凋亡的发生是一个主动过程，它依赖于大分子物质合成， 说明细胞凋亡是由基因调控的。 其中与mgso4组 、ir组比较：#p<0.01fas基因被认为是主要的凋亡促进基因［7］。本研究探讨了bre抑制神经元fas的表达减少神经元凋亡从而保护大脑的机制。
fas蛋白又称为apo1，现命名为cd95分子［8,9］。fas受体(即fas)与fas配体(fasl)分别属于肿瘤坏死因子受体(tnfr)及肿瘤坏死因子(tnf)家族［10］。以膜分子或可溶性分子形式存在于哺乳类动物机体中。fas主要以膜受体形式存在，fas分子由3部分组成：膜外的n末段区、跨膜区、膜内的c末段区。膜外区具有膜受体特征；fas的胞质区有一段约80个氨基酸组成的肽链，在细胞凋亡过程中起传递细胞凋亡信号的作用，故称之为死亡区域。
目前认为作为第二信使的蛋白激酶c(protein kinase c,pkc)参与脑缺血/再灌注中神经元凋亡的发生［11］。pkc抑制剂能显著地缓解缺血性损伤，然而，它具有巨大的毒副作用和价格昂贵等缺点。国内学者从传统中药灯盏花中分离得到的野黄芩甙元(又名灯盏花乙素), 发现它具有抑制pkc的作用, 并且属于非竞争性抑制, 从而为实验研究提供了基础［12］ 。
tunel染色是鉴定和量化细胞凋亡的精确方法［13］。本研究应用tunel方法证实，在脑缺血/再灌注后，bre可以通过减少神经元凋亡而起到神经保护作用。应用免疫组化技术，用抗fas抗体检测活化的fas蛋白，在ir组，fas蛋白的活性显著升高，而在bre 治疗 组，fas蛋白的活性下降。
综上所述，脑缺血/再灌注损伤后，bre能减少神经元凋亡和保护大脑，这可能与抑制fas蛋白的表达有关。
【 参考 文献 】
［1］张人伟，张元玲，王杰生，等.灯盏花黄酮类成分的分离鉴定［j］.中草药,1988,19(5):199-201.
［2］唐省三,马亚珍.灯盏花注射液对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用［j］.陕西医学杂志,2004,33(7):600-602.
［3］唐省三.灯盏花素对大鼠脑缺血再灌注后凋亡相关蛋白的干预［j］.
