作者：董群伟，陈志峰， 陈少青， 孙奋勇，胡伶平，洪曼杰,梁超
【摘要】 目的 探讨牛膝脱皮甾酮（achyranthes bidentata ecdysterone,abe）对去卵巢大鼠骨质疏松的 治疗 作用。方法 选用8月龄sd雌性大鼠随机分5 组: 假手术组、去卵巢组、低剂量牛膝脱皮甾酮处理组abeⅰ、中剂量牛膝脱皮甾酮处理组abeⅱ、高剂量牛膝脱皮甾酮处理组abeⅲ，以及αd3处理组，药物灌胃，治疗3 个月后处死大鼠，进行相关的检测。结果 高剂量与中剂量abe能够明显改善去卵巢后大鼠的骨密度与各项生物力学及骨形态计量学指标，低剂量处理组也有一定的治疗作用。结论 牛膝脱皮甾酮对去卵巢大鼠骨质疏松具有防治作用，并呈剂量依赖性。
【关键词】 牛膝脱皮甾酮；骨质疏松；骨密度；骨生物力学；骨形态学
abstract:objective to study the effect of achyranthes bidentata ecdysterone (abe) on osteoporosis in ovariectomized rats. methods 8monthold sd female rats were allotted to one of five groups: sham group,ovariectomized group and the three groups received different doses of abe respectively for three months.the parameters were measured after the sacrifice of the rats.results treatment with high and middle dosage of abe was capable of improving bone density as well as biological mechanical and bone histomorphometric indexes in ovariectomized rats,while lowdose of abe was less effective.conclusion abe shows effects on treatment of osteoporosis in ovariectomized rats in a dosedependent manner.
key words:achyranthes bidentata ecdysterone；osteoporosis； bone mineral density (bmd)； biomechanical
testing； histomorphometry
绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis，pmo）是原发性骨质疏松症中最常见的一种，其患病率为30% ～50%。www.11665.coM骨质疏松症具有骨显微结构的退化（骨小梁变细、断裂、小梁孔隙增大等）及骨强度降低，遇轻微创伤便易发生骨折［1］。妇女在绝经前后最常发生的是桡骨远端骨折及椎体压缩骨折。因此，骨质疏松症的防治已受到世界各国的重视。防治目的是减轻痛苦，预防发生骨折，提高老年妇女生活质量。
怀牛膝为苋科植物牛膝的干燥根,为“四大怀药”之一。具有补肝肾、强筋骨、逐瘀通经、引血下行之功,主要用于腰膝酸痛、筋骨无力、经闭症瘕、肝阳眩晕之症。历代 文献 明确为治疗“骨痹”、“骨痿”的方剂共21个，涉及药物77种，其中牛膝出现11次。课题组在前期研究工作中运用中药血清学、反义核酸封闭、cdna 芯片等多种技术发现牛膝脱皮甾酮(abe)能够有效促进成骨细胞的增殖，其分子机制与pka介导的通路有关 ［2-4］。本研究拟通过去卵巢大鼠的动物模型，观察牛膝脱皮甾酮对绝经后骨质疏松的治疗作用，以进一步阐明中药牛膝抗骨质疏松的作用，为牛膝脱皮甾酮的临床应用打下基础。
1 材料与方法
1.1 试剂与动物
牛膝脱皮甾酮（achyranthes bidentata ecdysterone,abe）由美国犹他州立大学药学院王兴河教授惠赠。αd3，以色列梯瓦制药 工业 有限公司生产。8 月龄雌性sd 大鼠（合格证号：粤检证字第2006a047号），体质量(267.18±21.15)g,按清洁级标准饲养，大鼠可以自由进食和饮水，各组大鼠均无妊娠和生育史。
1.2 动物模型制备
8 月龄未交配的雌性sd 大鼠分笼饲养，自由摄食和摄水，使用标准饲料，其中钙含量1.33 %，磷含量0.95 %。 随机分为假手术组、去卵巢组及abeⅰ、ⅱ、ⅲ组、αd3组（阳性对照），每组10 只。除假手术组（单纯切开皮肤不做卵巢切除）大鼠外，其余行双侧卵巢切除术，假手术组和去卵巢组均用体积分数为50% 的乙醇(溶剂对照)0.5 ml,abeⅰ、ⅱ、ⅲ组分别用1.0,2.0,4.0 mg/kg/d abe灌胃给药。所有动物给药时间为5周，每周称体质量1 次，按体质量变化调整给药量，各组体质量均无明显差异。此外，各组小鼠的雌激素水平都采用雌二醇试剂盒(sigma 公司)严格监控，在整个饲养过程中都没有明显变化，假手术组雌激素水平为（17.88±2.45） pg/ml，其余各组雌激素水平为（9.31±0.58） pg/ml。
1.3 大鼠血清生化指标的检测
全自动生化分析仪测定血清ca 、p 及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，alp) 的活性。
1.4 大鼠骨密度的检测
采用美国hologic双能x线骨密度仪(精度1%; cv<1%,g/cm2 )检测腰椎骨(l1-5) 和左股骨的骨密度(bone mineral density,bmd) 。扫描密度为17.912 cm,点分辨率为0.064 0 cm。
1.5 离体股骨生物力学指标的检测
取大鼠左股骨,去除附着肌肉及近侧端关节软骨,用-80 ℃的超低温冰箱保存。使用时从冰箱取出复温,以万能 电子 材料试验机进行生物力学检测。
1.6 骨组织形态计量学分析
取大鼠右股骨标本，放入70 %（φ）酒精，4 ℃冰箱内固定3 d后，依次放入80 %、95 %酒精中脱水各24 h,纯丙酮中脱水2 次，二甲苯透明2 次，渗透液内渗透过夜。包埋，干燥器中放置4 h 后，40～60 ℃温箱中固化24 h后切出10 μm 厚切片， 采用1 %甲苯胺蓝染色。测量的形态参数：①骨小梁数目(tb.n) 即每mm2 骨小梁的数量。②骨小梁的宽度［th.t(μm)］即测量吸收陷窝附近的同一骨小梁的宽度。③骨小梁的体积［tbv (mm3)］即包括骨小梁矿化和未矿化的类骨质体积之和。④骨小梁间隙［th.s(μm)］即骨小梁板间的距离。⑤平均皮质骨厚度(μm) 即所测范围内骨皮质宽度的平均值。⑥骨小梁体积占全部骨组织的百分比(tbv/ttv %)。
1.7 统计学处理
各组数据均用（±s）表示，用spss 10.0统计软件进行统计分析。采用t检验,p<0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 abe处理对去卵巢大鼠血清生化指标的影响
去卵巢组大鼠的alp与假手术组相比明显升高（p<0.01），abe各处理组的alp浓度下降，且呈现明显的量效关系；血清ca、p的浓度各组之间差异无显著性。见表1。表1 abe处理对去卵巢大鼠血清生化指标的影响（略）
2.2 abe处理对大鼠骨密度的影响
去卵巢组大鼠与假手术组相比，腰椎与股骨的骨密度明显降低（p<0.01），而各abe处理组均能明显促进骨密度的增加。其中高剂量处理组abe(ⅲ)的治疗作用最为明显，接近或达到假手术组的水平。表2 abe处理对去卵巢大鼠骨密度的影响（略）
2.3 abe处理对大鼠骨组织生物力学特性的影响
与假手术组相比，去卵巢组大鼠左后肢离体股骨各项骨生物力学指标均明显下降(p<0.01) 。而中、高剂量abe处理组与去卵巢组大鼠相比,均能明显改善骨生物力学性能 (p<0.01),具有明显抗压、抗折作用，而低剂量处理组没有明显作用。见表3。
2.4 abe处理对大鼠骨形态计量学指标的影响
与假手术组相比，去卵巢组大鼠股骨干骺端各形态计量指标均明显变化( p<0.01)，其中骨小梁间隙［th.s(μm)］明显上升，其余指标明显下降。而各剂量abe处理组与去卵巢组大鼠相比，均能明显改善骨形态计量指标，其中，中、高剂量组的作用更为明显 (p<0.01) 。见表4。表3 abe处理对去卵巢大鼠骨生物力学的影响（略）表4 各组大鼠股骨干骺端形态计量参数比较（略）
3 讨 论
雌性大鼠的卵巢切除后，雌激素水平降低、骨代谢活跃、骨转换增强、骨量丢失，是经典的模仿人正常绝经时高转换型骨质疏松症的模型。雌性大鼠在6～9个月时进入骨生长静止期,这时的骨代谢相对稳定,骨膜扩展直到10个月时结束。一般采用月龄6～10个月的大鼠复制绝经后骨质疏松症模型,此时有足够的骨小梁再建,适于实验观察。因此本实验采用8月龄sd大鼠摘除卵巢复制绝经后骨质疏松症模型。
前期的研究结果表明，牛膝脱皮甾酮(abe)能够有效促进成骨细胞的增殖［2-4］。本研究表明，牛膝脱皮甾酮高、中剂量组对于去卵巢造成的骨质疏松具有明显的 治疗 作用，而且具有一定的剂量依赖关系。在血清生化指标中，碱性磷酸酶是最常用的评价骨形成的指标。血清中碱性磷酸酶有50%来源于骨,碱性磷酸酶值升高是高转换型骨质疏松症表现之一［5,6］。本研究显示,去除卵巢导致血清中碱性磷酸酶明显升高,符合高转换型骨质疏松症模型的 规律 ,应用不同的abe剂量进行干预，可降低血清碱性磷酸酶，进而对抗去卵巢后的高转换型骨质疏松症。值得注意的是，体内通过骨、肠和肾的相互联系、相互制约,使血钙和钙离子调控达到正常水平。血浆和细胞外液的磷酸离子浓度是骨矿物质形成和吸收的关键性因素,过高和过低对骨基质的合成和矿化都不利。本实验各组间的血ca和血p水平差异没有显著性,说明经过机体不断调节使其保持在一个较稳定的状态。
骨密度是目前用于骨质疏松症诊断及骨折危险度评价最重要、最客观的检测指标，检测结果表明，abe处理能够明显改善骨密度的降低。生物力学的研究结果显示，虽然低剂量组的作用并不十分明显，但中、高剂量组能够显著改善去卵巢大鼠骨组织的生物力学特性，增加骨组织承载能力,提高骨骼抵抗外力冲击的能力。形态计量学的研究进一步说明，3种剂量的abe都在一定程度上改善各骨量参数，具有增加骨小梁骨量,延缓小梁变细、变稀,增加成骨的作用。
目前缺乏有效的措施使pmo患者的骨量恢复正常，药物治疗十分有限,而且存在争议［7,8］。国外列为首选的雌激素替代疗法虽然对绝经后骨质疏松症有一定的改善作用,但需长年服药(2年以上)。而且存在诱发生殖系统恶性肿瘤的危险。其他如口服钙剂、维生素d、氟化物等的治疗效果均受到质疑。本研究表明，使用牛膝脱皮甾酮能够改善雌激素减少导致的骨质疏松症。作为纯中药制剂,无雌激素长期使用产生的多种副作用,具有一定的研究和应用前景，为此药进一步的临床应用奠定了基础。
【 参考 文献 】
［1］cline r r,worley m m.osteoporosis health beliefs and selfcare behaviors: an exploratory investigation［j］. j am pharm assoc (wash dc),2006,46(3):356-363.
［2］潘秋辉，孙奋勇.双龙接骨丸促进成骨细胞的增殖及其分子机制的研究［j］.
