作者：姚旭，刘运美，罗星，黄进，赵娟妮，郑兴
【摘要】 目的通过提纯工艺的研究，提高灯盏乙素的纯度和得率。方法采用正交设计实验方案，选择灯盏乙素纯化最佳条件，用高效液相色谱法测定纯化后样品中灯盏乙素的含量。结果醇沉乙醇用量120 ml， 60%的乙醇溶解滤渣，酸化ph=1为最佳纯化工艺。结论该方法简单，操作简便，且能获得很好纯度和产率。
【关键词】 灯盏乙素; 正交设计; 纯化; 高效液相色谱
盏花始载于《滇南本草》， 又名灯盏细辛，属于短亭飞蓬，归类菊科飞蓬植物。飞蓬属约有二百种以上，而能入药的短亭飞蓬只有3种，1974年以来，被云南省制药工业广泛用作制药原料（《云南省药品标准》）。灯盏花素制剂从20世纪70年代开始应用于临床上，主要用于治疗高血压病、脑栓塞、多发性神经炎、慢性视网膜炎及脑血管意外所致的瘫痪症［1］。近年来有文献报道它治疗心脑血管疾病的主要活性成分为灯盏乙素（又名野黄芩苷）［2～4］。现在市售的灯盏花素多为含灯盏乙素90%左右的粗品，其进一步纯化工艺还没有相关文献报道。本实验采用正交实验法对其纯化工艺进行研究，并采用高效液相色谱法检测纯化后样品中灯盏乙素含量［5～7］。Www.11665.CoM
1 仪器与试剂
高效液相色谱仪（日本岛津公司lc2010a型）；kq-250de数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；电子分析天平bt25s(日本岛津)。灯盏花素（云南植物药业有限公司）；野黄芩苷（对照品110842-200504，中国药品生物制品检定所）；乙醇（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；甲醇（色谱醇，天津市科密欧化学试剂有限公司）；h3po4（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；naoh（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；水为双蒸水；其余试剂均为分析纯。
2 方法
精密称取灯盏乙素粗品1g溶于磷酸盐缓冲溶液，加0.2 mol/l的氢氧化钠使之全部溶解（ph<8），加无水乙醇沉淀，过滤，滤渣用60%乙醇溶解，稀盐酸调ph=1值，有沉淀析出，过滤，滤渣水洗，50℃真空干燥，即得高纯度灯盏乙素。
3 结果
3.1 灯盏乙素的测定
3.1.1 色谱条件
色谱柱为c18柱；流动相为甲醇-0.1%磷酸（40∶60）；检测波长335 nm；流速1.0 ml/min；柱温为室温。进样量10 μl。
3.1.2 样品液的测定
精密称取“2方法”项所得灯盏乙素样品用甲醇配成0.1 mg/ml样品溶液。按“3.1.1”项下色谱条件进样。色谱图见图1。
3.1.3 标准曲线的制备
准确称取野黄芩苷对照品10 mg，于比色管中甲醇定容至10 ml，即为浓度为1 mg/ ml对照品溶液。分别取0.25，0.5，1，1.5，2.0，2.5 ml稀释至10 ml，配成0.025，0.05，0.1，0.15，0.2，0.25 mg/ ml系列标准液，进样测定峰面积。以峰面积（y）与进样浓度（x）进行线性回归，得回归方程为y=1.0×107x-314 548，r=0.997 7，线性范围25.00～250.00 μg/ml。
3.1.4 精密度实验
精密量取0.05，0.1，0.2 mg/ ml的野黄芩苷对照品溶液按上述色谱条件，分别重复测定5次。计算rsd值分别为0.15%，0.19%，0.23%，表明测定方法精密度良好。
3.1.5 稳定性实验
精密量取“3.1.2”项下样品液分别于0，1，2，4，6，8 h内进样测定。测得rsd值为0.35%，表明灯盏乙素样品液在8 h内稳定。
3.1.6 重复性实验
取6份灯盏乙素粗品，按“2方法”项下方法进行纯化，按“3.1.2”项方法配制样品液，按“3.1.1”项下色谱条件进样测定，计算rsd为0.15%（n=6），表明测定方法重复性良好。
3.2 正交实验结果分析
根据灯盏乙素碱提酸沉的步骤及初步筛选的结果，正交实验设计考察的的因素确定为沉淀用乙醇用量（a）、溶解沉淀乙醇的浓度（b）、酸沉ph值（c），以灯盏乙素的纯度和得率作为考察指标，采用正交表设计，因素与水平见表1。表1 因素水平（略）
取灯盏乙素粗品按正交设计方案进行实验，测定，以灯盏乙素的百分含量和产率为综合指标进行分析。结果见表2。 综合评分标准：以灯盏花乙素的纯度100%为满分，得率以100%为满分；综合评分按得率占50%，纯度占50%。
从表2中可以看出，各因素对灯盏乙素纯度的影响大小顺序为b>c>a，对得率影响的大小顺序为a>c>b。综合各种因素，提取工艺的最佳组合为a3b3c1。表2 正交实验结果（略）
3.3 工艺验证实验以最佳纯化工艺纯化灯盏乙素粗粉5 g，各3份，按最佳提取工艺纯化，母液回收再重结晶，hplc测定灯盏乙素的含量。结果见表3。平均得率88.45%，纯度98.27%，说明此工艺稳定可行。表3 验证实验结果（略）
4 结论
本实验表明灯盏乙素碱提酸沉法重结晶的最佳工艺参数为每克样品用120 ml乙醇沉淀，沉淀用60%乙醇溶解，稀盐酸调 ph=1，静置，滤过，真空干燥，产率和纯度较好。该方法简单，操作简便。
【参考文献】
［1］丁国华.灯盏花素药理研究和临床应用进展［j］.时珍国医国药，1999,10（4）：303.
［2］李丽，刘东阳，江骥，等．灯盏乙素药理学研究进展［j］.中成药，2006,37（8）：附9.
［3］居文政，许美娟，谈恒山．灯盏乙素药动学研究进展［j］.中草药，2007,8(9):附4.
［4］马宇辉，罗国安，王义明．灯盏花研究近况［j］.中成药，2004,6（1）：63.
［5］戚爱棣．高效液相色谱法测定灯盏花素片中灯盏花乙素的含量［j］.中草药，2003,4（4）：322.
［6］邹薇，何国华，魏东峰．高效液相色谱法测定灯盏花素分散片中灯盏乙素的含量［j］.中药新药与临床药理，2003,4（3）：190.
［7］张晓喻，李琪，杨必坤，等．rp-hplc测定灯盏花素分散片中灯盏花乙素的含量［j］.现代仪器，2008,1：37.
