作者：陆家政，杜一凡，韦国锋，李振中
【摘要】 目的 研究卟啉荧光素二元化合物体外清除活性氧自由基及抗氧化的作用。方法 利用光照核黄素产生超氧阴离子自由基o2-·和fenton反应产生羟自由基·oh，用分光光度法测定卟啉荧光素二元化合物体外清除活性氧自由基的作用，用硫代巴比妥酸( tba)分光光度法研究卟啉荧光素对·oh诱发卵磷脂脂质过氧化和dna氧化损伤的抑制作用。结果 卟啉荧光素二元化合物能有效清除活性氧自由基，对卵磷脂脂质过氧化和dna氧化损伤有显著抑制作用。结论 卟啉荧光素二元化合物是一种良好的体外抗氧化剂。
【关键词】 卟啉荧光素；活性氧自由基；抗氧化；体外
abstract:objective study the scavenging effects of porphyrinfluorescein hybrid on scavenging of reactive oxygen species and inhibition of oxidative damages in vitro. methods the scavenging effects of porphyrinfluorescein hybrid on reactive oxygen species·oh and o2-· generated by fenton reaction and riboflavin photosensitization were investigated by the means of spectrophotometry. and the inhibition effects of porphyrinfluorescein hybrid on lipid peroxidation in the presence of lecithin and oxidation damage of dna chain induced by hydroxyl radical were observed by spectrophotometry with thiobarbituric acid. results the results showed that porphyrinfluorescein hybrid could scavenge reactive oxygen species efficiently. it could also significantly inhibit lipid peroxidation in the presence of lecithin and oxidation damage of dna by hydroxyl radical. conclusion the porphyrinfluorescein hybrid was an effective antioxidant in vitro.
key words:porphyrinfluorescein hybrid; active oxygen; antioxidation; in vitro
卟啉及其衍生物作为高等植物或光合细菌叶绿素分子的结构类似物，在光合作用、生命过程中起着重要的作用。wWW.11665.cOm另一方面，荧光素及其衍生物在结构上具有的特殊性导致了其物理化学性质具有某些特殊性。这类化合物在一定的介质中呈强烈的荧光，常常被用作指示剂及生物细胞染色剂，在医疗上荧光素可用于防癌的 治疗 ，是一种防腐药和轻泻剂。某些过渡金属离子和荧光素的配合物，尤其是cu(ⅱ)、zn(ⅱ)、co(ⅱ)等的荧光素配位化合物具有抗癌的药理作用，而荧光素汞的配合物则具有防腐性能等［1-4］。荧光素及衍生物在生物学和医学上有极为重要的应用，目前仍是一类常用的荧光探针和诊断试剂。它是基于这类分子很强的荧光发射能力及其发光特性随环境而变化的特征。叶芳贵等［3］利用dna 对荧光素(fl)中性红(nr) 分子间荧光能量转移的抑制作用,以荧光素中性红为荧光探针,考察该探针与dna 的结合反应,建立了准确测定dna 的新方法。但卟啉荧光素二元化合物体外抗氧化作用的研究尚未见报道,本实验主要研究卟啉荧光素二元化合物对活性氧自由基的清除作用及对卵磷脂和dna体外脂质过氧化抑制作用。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
卟啉荧光素二元化合物由本实验室合成［1］，并以元素分析、uvvis、ir、1h nmr和esims进行了表征；硅胶g(柱层析用，青岛海洋化工厂)；ch2cl2(ar,广州化学试剂厂)，在使用前按常规方法提纯；氯化硝基四氮唑兰(nbt)（chem.base公司）；芦丁标准品、蛋氨酸、鲱鱼精dna（sigma公司）；核黄素(vb2)、番红花红(safranine t)、2硫代巴比妥酸(tba)（ar, fluka公司）；三氯乙酸(tca)（上海试剂一厂）；所用试剂均为分析纯。
shimadzu uv3101 pc 光谱仪（日本岛津公司）；光照箱，自制, 35 cm×30 cm ×25 cm，光源为纯稀土节能灯，灯功率45 w,欧姆龙（亚洲）公司；hhs8数显恒温水浴锅（江苏春兰实验仪器厂），低温超速离心机（beckmanj20xpi， 美国 beckman 公司）。
1.2 方法
1.2.1 超氧阴离子自由基的产生及清除活性测定
采用光照核黄素［5-7］的方法,用0.05 mol·l-1、ph=7.4的pbs缓冲液为溶剂,配制3.5×10-6 mol·l-1核黄素，0.01 mol·l-1蛋氨酸， 4.5 ×10-5 mol·l-1氯化硝基四氮唑兰(nbt)。分别取上述3种溶液各2.0 ml,加入各种浓度的卟啉荧光素(样品)溶液1.0 ml，空白管以1.0 ml缓冲液代替样品溶液。置于光照箱中光照30 min，取出后以缓冲溶液为参比，于590 nm处测定溶液的吸光度。清除率按下式 计算 ：a0为空白管的吸光度，a样为样品管的吸光度。
1.2.2 羟自由基的产生及清除活性测定［4,8］
采用亚铁离子催化过氧化氢产生羟自由基( fenton反应)，该反应产生的羟自由基可使番红花红褪色，针对这一特点来研究卟啉荧光素对羟自由基的清除能力。取0.15 mol·l-1、ph 7.4 的磷酸缓冲溶液1.0 ml, 40 μg·ml-1番红花红1.0 ml, 0.195 mmol·l-1 edtafe (ⅱ) (新鲜配制) 1.0 ml, 不同浓度的卟啉荧光素 (样品) 0.5 ml，3% h2o2 1.0 ml (新鲜配制),混合后在37 ℃水浴中反应30 min, 在520 nm 处测定吸光度，以a样表示。空白组以0.5 ml蒸馏水代替样品，测定吸光度a0，对照组以1.5 ml蒸馏水代替h2o2 和样品，测定吸光度a，用3.5 ml蒸馏水代替番红花红、edtafe (ⅱ) 、h2o2 、样品，用1.0 ml磷酸盐缓冲溶液调零。按下式计算清除率:
清除率(％)=a样-a0a-a0×100%
1.2.3 对脂质过氧化抑制活性的测定［4-8］
取0.12 ml卵磷脂溶液( 300 mg 卵磷脂溶解于30 ml 10 mmol·l-1 、ph 7.4 的pbs 中, 冰浴震荡), 加入ph7.4的pbs 缓冲液1.0 ml, 取不同浓度的卟啉荧光素样品溶液0.5 ml, 2.5 mmol·l-1 edtafe ( ⅱ) 1.0ml，混匀后于37 ℃水浴中反应40 min, 再加入28% (w∶v ) 的tca 2.0 ml, 1% (w∶v) 的tba 1.0 ml，混匀后置于100 ℃沸水浴中加热10 min，冷却后在532 nm处测定吸光度a样，用pbs缓冲液调零，空白管用pbs缓冲液代替样品，测吸光度a0 。按下式计算抑制率:
抑制率(％)=a0-a样a0×100%
1.2.4 ·oh 引发dna损伤抑制tba法测定［4,10］
取ph7.1的trishcl 缓冲溶液1.0 ml, 4.0 mg·ml-1dna 0.2 ml, 不同浓度的卟啉荧光素溶液0.20 ml, 25 mmol·l-1 edtafe (ⅱ) 1.0 ml, 3% h2o2 1.0 ml(新鲜配制)，在37 ℃水浴中恒温1.5 h后，取出加入28% (w∶v) 的tca 2.0 ml，1% (w∶v ) 的tba 1.0 ml，混匀后置于100 ℃沸水中加热10 min，冷却后于波长532 nm处测吸光度，即a样。空白管以0.15 ml 蒸馏水代替样品测a0，用相应缓冲溶液作参比。抑制率按下式 计算 ：
2 结果与讨论
2.1 对超氧阴离子自由基的清除作用
为更好地考察卟啉荧光素对光照核黄素产生超氧阴离子自由基的清除效果，本研究以芦丁作为对照实验，分别测定了卟啉荧光素和芦丁的清除作用。卟啉荧光素与芦丁对光照核黄素产生超氧阴离子的清除作用见图1。 卟啉荧光素ic50=20 μg·ml-1，当质量浓度为100 μg·ml-1时，清除率可达61.33%；芦丁ic50=50 μg·ml-1，当质量浓度为100 μg·ml-1时，清除率可达77.62%，与 文献 报道结果一致［4,5,7］。由图1可见，卟啉荧光素对超氧阴离子自由基具有较好的清除作用，与芦丁对超氧阴离子自由基的清除效果相当。
2.2 对fenton反应产生·oh的清除作用
以芦丁为对照，卟啉荧光素对fenton反应产生·oh的清除作用见图2，卟啉荧光素ic50=0.50 μg·ml-1,质量浓度≥3.5 μg·ml-1时，清除率达最大，其最大清除率为63.5 %；而芦丁ic50=2.5 μg·ml-1，与卟啉荧光素相同浓度下的最大清除率为65.6%，这说明卟啉荧光素和芦丁一样对·oh自由基具有良好的清除作用。
2.3 对脂质过氧化的抑制作用
在532 nm下测定卟啉荧光素对卵磷脂脂质过氧化的抑制作用，结果见图3，由图可知，卟啉荧光素的ic50=0.05 mg·ml-1，样品浓度和抑制率呈正相关。当卟啉荧光素的质量浓度为3.0 mg·ml-1时, 其抑制率高达60.5%，由此可见，卟啉荧光素对卵磷脂脂质过氧化也表现出较好的抑制作用。
2.4 对·oh引发dna损伤的抑制作用
硫代巴比妥酸(tba)可与丙二醛(mda)类似物反应，生成粉红色物质，该物质在532 nm处有最大光吸收，采用tba反应可定量检测脱氧核糖或dna上脱氧核糖环受·oh攻击，氧化断裂产生的丙二醛类似物［4,6,8］。卟啉荧光素二元化合物对·oh引发dna损伤的抑制作用结果见图4，加入卟啉荧光素化合物后，dna的氧化损伤被抑制，抑制率随卟啉荧光素浓度的增加而增加。卟啉荧光素ic50=1.5 μg·ml-1，当卟啉荧光素的质量浓度为4.0 μg·ml-1时，其抑制率高达68.6%；芦丁ic50=2.0 μg·ml-1，当质量浓度为4.0 μg·ml-1时，抑制率为85.2%，说明卟啉荧光素化合物能有效抑制mda生成，对dna上脱氧核糖的氧化损伤抑制作用较好。
3 结 论
荧光素及其一些衍生物临床上已应用于癌症的 治疗 等，它们也是防腐药和轻泻剂；从化学结构上分析，卟啉荧光素属于蒽醌类物质［2,3,8,9］。本实验所用的卟啉荧光素二元化合物的结构式如图5所示，它的主要活性部位是荧光素环上的羟基氢和具有共轭大π键的卟啉环，卟啉环因其具有较强配位作用也属于活性基团之一。因此，有理由认为卟啉荧光素的抗氧化活性主要是由于蒽醌环上的羟基氢发生作用，卟啉环的活性也不容忽视。本实验研究表明,卟啉荧光素化合物具有较好的清除活性氧自由基能力，并对卵磷脂脂质过氧化及·oh诱发dna氧化损伤有显著的抑制作用。卟啉荧光素二元化合物是一种良好的体外抗氧化试剂，其相关机理仍需进一步研究。
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