【摘要】 目的 探讨单侧和双侧电刺激对脑梗死大鼠梗死灶周围nogoa、nogo受体(ngr)表达和神经功能恢复的影响及作用机制，为电刺激在脑梗死治疗及康复中的应用提供理论依据。方法 利用线栓法制作大鼠局灶性脑梗死模型，将造模成功且存活的脑梗死大鼠分为对照组、单侧电刺激组、双侧电刺激组（各32只），另外假手术组32只、正常组8只。对照组、假手术组自然恢复；单、双侧电刺激组接受电刺激治疗。于第1、3、7、14、21d利用平衡木实验检测各组大鼠神经功能情况，第3、7、14、21d利用免疫组化检测梗死灶周围皮质nogoa和ngr阳性蛋白的表达。结果 电刺激治疗的大鼠运动功能的恢复较对照组明显改善（p＜0.05），双侧电刺激组恢复优于单侧电刺激组。正常组与假手术组各时间点nogoa和ngr表达差异无统计学意义（p＞0.05），脑梗死后第3、7d对照组nogoa的表达明显高于假手术组，电刺激后nogoa的表达较对照组下降（p＜0.05），双侧电刺激组较单侧电刺激组下降（p＜0.05）。脑梗死后3d至21d对照组与假手术组ngr表达差异无统计学意义（p＞0.05），电刺激后ngr表达较对照组下降，双侧电刺激组ngr的下降较单侧电刺激组明显。结论 电刺激能够促进脑梗死大鼠神经功能的恢复，双侧电刺激效果优于单侧电刺激，下调nogoa和ngr的表达可能是其促进运动功能恢复的机制之一。
【关键词】 脑梗死 电刺激 运动功能 nogo a nogo受体 大鼠 spragne dawley
nogoa and nogo receptor after acute cerebral infarction in rats
yang bing， zhang xiuqing， tang jiyou， song yun， sun qinjian
（department of neurology, qianfoshan hospital affiliated to shandong university, jinan 250014, china）
to investigate the mechanisms of electric stimulation in improving neurorehabilitation by observing the effects of impaired limbs and bilateral electric stimulation on motor function and expressions of nogoa and nogo receptor (ngr) following acute cerebral infarction in experimental rats. methods adult male spraguedawley (sd) rats were randomly divided into the normal (8 rats), sham operation, control, impaired limb and bilateral electric stimulation groups (each group had 32 rats). the acute cerebral infarction model was mimicked by using the middle cerebral artery occlusion (mcao) technique. after cerebral infarction for 24h, the rats were treated with or without electric stimulation everyday according to different groups, followed by evaluation of the motor function and expression of nogoa and ngr in the border zone of cerebral infarction for 3, 7, 14 and 21 days by using the beam walking test (bwt) and immunohistochemistory. results motor function was significantly improved in the treatment groups with electric stimulation compared with the control group(p＜0.05). also, the effect of the bilateral electric stimulation on recovery of motor function was better than that of the impaired limb treatment. further studies demonstrated that the expressions of nogoa and ngr were remarkably increased in the control and treatment groups after cerebral infarction for 3 days (p＜0.05) in contrast to the sham operation group, and were decreased after 7 days and returned to the basal level following 21 days, whereas no significantpoint. when compared with the control group, the expressions of nogoa and ngr in the treatment groups were significantly reduced after cerebral infarction for 3 day, however, no significant differences were found after 21 days, in contrast to the impaired limb electric stimulation group, they were lower in the bilateral treatment group 7 days after cerebral infarction (p＜0.05) and returned to the same level of the impaired limb treatment group after 14 days. conclusions treatment of acute cerebral infarction with electric stimulation, in a particular bilateral stimulation, can improve the movement of the paralyzed extremities and downregulate the expressions of nogoa and ngr. therefore, improvement of motor function by electric stimulation involves the inhibition of nogoa and ngr expressions after acute cerebral infarction.
key words: cerebral infarction； rehabilitation； electric stimulation； motor function； nogoa; ngr 脑卒中患者多遗留肢体瘫痪，严重影响患者的生存质量促进肢体功能恢复的手段已成为目前研究的方向。wWw.11665.COm近年来研究表明，脑卒中后给予外围电刺激治疗能够明显改善偏瘫肢体功能的恢复［13］，其机制尚不完全清楚。nogoa和nogo66受体存在于中枢神经系统(central nervous system，cns)中，能抑制神经轴突再生，在维持cns内环境的稳定中发挥重要作用。然而由于这些抑制因子的存在，当中枢神经受到不可逆损伤时，即使存在促进神经生长的因子，受损的神经功能仍不能完全恢复。因此减少cns损伤后nogoa和nogo受体(nogo receptor ngr)的表达，对于促进神经功能的恢复是非常重要的诱导方法之一。本研究通过大鼠脑梗死后给予单、双侧肢体电刺激治疗的实验研究，探讨电刺激对肢体功能恢复以及nogoa 、ngr表达的影响。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器 兔抗大鼠nogoa igg购自santa cruz公司；兔抗大鼠nogo r购自北京博奥森生物技术有限公司；链酶亲和素-生物素-过氧化酶复合物（streptavidinbiotinperoxidase complex，sabc）试剂盒和二氨基联苯胺（diaminobenzidine，dab）显色液购自武汉博士德生物工程有限公司；电刺激仪（bt7011a）购自上海华谊医用仪器有限公司。
1.2 实验动物分组 健康雄性spraguedawley(sd)大鼠，由山东中医药大学实验动物中心提供，体质量250～300g，自然光照，饲养环境的温度为20～22℃。利用线栓法制作大鼠左侧脑梗死模型，将造模成功且符合入选条件并存活的128只大鼠再随机分为对照组、单侧电刺激组和双侧电刺激组，各32只，另外正常组8只、假手术组32只。各组分别在造模后3，7，14，21d处死8只大鼠。所有大鼠均于术前1周每隔1d进行2次横木行走训练。
1.3 脑梗死模型制备 选用日本产尼龙线，直径0.205mm，每段长40mm，头端烧成光滑球形，于距球形端18.5mm处作一标记，用75%乙醇消毒后置肝素化生理盐水中备用。参考廖维靖等和longa等的线栓造模方法制备大鼠左侧大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，mcao）模型［45］。术中保持室温22℃，麻醉期间用40w白炽灯照射加温，并用肛表持续监测直肠温度，使之维持在(37±1)℃。术后将动物置于放有清洁垫料的饲养笼内，自由饮水、进食，必要时给动物喂水。假手术组线栓只插至距颈总动脉分*5mm处的颈内动脉内。
1.4 动物模型判定及纳入标准 参考longa的5分制评分标准，在手术结束、大鼠麻醉清醒后进行评分:0分：无神经功能缺失；1分：轻度局灶性神经功能缺失(不能完全伸展右前肢,提尾悬吊时右前肢屈曲)；2分：中度局灶性神经功能缺失(爬行时向右转圈,追尾)；3分：重度局灶性神经功能缺失(爬行时向右倾倒)；4分：不能自主行走，意识障碍。术后评分为1～3分大鼠纳入实验。
1.5 干预措施 假手术组、对照组不予特殊处理，单、双侧电刺激组从造模成功24h后行电刺激治疗。单侧电刺激组行偏瘫侧肢体电刺激；双侧电刺激组行偏瘫侧和正常侧肢体电刺激；对照组及假手术组不予电刺激治疗。后肢刺激环跳和阳陵泉，前肢刺激肩盧和曲池，频率3hz，强度以肢体微微抖动为宜，每只大鼠每天实施电刺激的时间相对固定。除3d组外，各组电刺激6d休息1d。
1.6 神经功能评分 根据feeney等［6］的走横木实验(beam walking test，bwt) 方法于左侧大脑中动脉闭塞后第3、7、14、21d评价大鼠的精细运动功能恢复情况。横木由120cm×2.5cm的木板制成，一端为强光及噪音刺激，对侧端为黑笼子。入选的mcao大鼠均于术前1周每隔1d进行测试训练2次。bwt评分等级为1～7分：7分：能顺利爬行平衡木，瘫痪肢体完全起作用，无明显神经体征；6分：能爬过平衡木，瘫痪肢体起作用大于50%；5分：能爬过平衡木，瘫痪肢体起作用小于50%；4分：不能顺利爬过平衡木，跌倒几率小于50%；3分：不能顺利爬过平衡木，跌倒几率大于50%；2分：在平衡木上不能行走，但可坐在上面；1分：完全不能爬过平衡木且无法将后肢放在水平位，放在平衡木上会掉下来。
1.7 免疫组织化学方法检测梗死灶周围nogoa及ngr表达 于左侧局灶性脑梗死后第3、7、14、21d各组处死8只大鼠，利用免疫组化方法检测nogoa及ngr表达。腹腔注射过量3.5%水合氯醛麻醉后，开胸暴露心脏，剪开右心耳，从左心室置管灌注预冷的4℃肝素化生理盐水(50u/ml)250ml，将血液冲洗干净，随后予4%多聚甲醛250ml灌注固定30min，然后断头取脑，参照大鼠脑立体定位图谱，冠状面切取前囟前后2mm部分放入10%中性缓冲福尔马林溶液中后固定48h，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，取缺血中心部位脑片(前囟嘴侧0.2～0.8mm)，行常规he染色及sabc免疫组化染色；按试剂盒说明书进行免疫组化染色，最后切片经梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树脂封固，镜下观察。对照实验：以正常羊血清和pbs代替nogoa和ngr抗体，同步进行上述免疫组化染色。每张切片取梗死周边区不同的3个视野进行照像(olympus光学显微镜，×400)，利用imagepro plus6.0图像分析系统测定梗死周边区免疫表达物阳性反应产物iod的sum值。每只大鼠取3张相同缺血部位脑片，求其算术平均值。
1.8 统计学处理 实验数据以
2 结 果
2.1 脑梗死大鼠电刺激后bwt评分 见表1。对照组第3d与第7d瘫痪肢体功能恢复不明显，至第14d肢体功能恢复较前明显改善（p＜0.05），第21d肢体功能较第14d改善（p＜0.05）。单、双侧电刺激组均随治疗时间的延长瘫痪肢体功能恢复明显（p＜0.05）。第3d，对照组、单侧电刺激组、双侧电刺激组肢体功能恢复差异无统计学意义（p＞0.05）。第7、14、21d时，单侧电刺激组恢复较对照组好，双侧电刺激组恢复较单侧电刺激组好（p＜0.05）。
3 讨 论
cns存在大量髓鞘来源的抑制因子，nogoa是其中最重要的一种。nogoa具有2个抑制性功能结构域，一个是跨膜环状nogo66，与神经元细胞膜表面的ngr结合；另一个是较长的氨基端区(aminonogo)，定位于胞质内。研究显示，在成年大鼠的cns中，nogoa广泛表达在神经元和少突胶质细胞中，它通过ngr/p75/lingo1复合体上调camp和ca2+，然后作用于rhoa，激活下游靶分子rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶（rho associated coiled coil forming protein kinase, rock）来调节细胞微丝骨架蛋白，使生长锥瘫痪，从而抑制轴突生长［7］。wang等［8］将出生后7d的大鼠造成缺血缺氧模型（hypoxicischemic，hi），发现缺血后皮质神经元发生变性和水肿，并在hi后24h最为明显，这与nogoa和ngr的表达是完全一致的，表明nogoa和ngr可能参与新生大鼠hi后神经元变性、水肿等病理生理改变。本研究结果显示，脑梗死后第3、7d，nogoa的表达明显升高，此后逐渐恢复到基础水平，而ngr的表达在脑梗死后第3d已恢复至正常，脑梗死14d后，nogoa和ngr的表达均恢复正常水平。由此可以推测，急性脑梗死诱导nogoa和ngr的早期表达，尤其是ngr的表达明显早于nogoa，这可能是脑梗死后神经功能难以恢复的原因之一。
电刺激是临床脑卒中后康复治疗的一种有效手段，具有增加脑血流量、增加梗死区残留神经元百分比、减轻脑肿胀、减少脑梗死体积、诱导血管内皮生长因子表达等生物学效应，对促进瘫痪肢体功能恢复发挥着重要作用［910］。本研究利用bwt观察脑梗死后大鼠四肢的精细运动及恢复情况，结果显示：大鼠左侧脑梗死后第1d， 对照组、单、双侧电刺激组bwt评分仅为1分，脑梗死后第7d各组bwt评分提高，说明急性脑梗死后运动功能存在着自然恢复的过程；脑梗死后第14、21d电刺激组大鼠运动功能恢复较对照组明显改善，提示电刺激可以促进急性脑梗死后运动功能的恢复。
大量研究［1114］显示，使用nogoa或ngr抗体治疗脑梗死大鼠，能观察到从未受损皮质到皮质下区域形成新的轴突联接，增强运动皮质的可塑性，促进瘫痪前爪运动功能的恢复。因此，阻止或/和下调nogoa和ngr的表达能改善瘫痪肢体的预后。本研究发现，电刺激能降低脑梗死灶周围nogoa和ngr的表达，双侧电刺激的下调作用更加明显。双侧电刺激组大鼠肢体功能恢复优于单侧电刺激组，这可能与双侧电刺激能更明显抑制了nogoa和ngr的表达有关。
综上所述，电刺激治疗能够促进大鼠脑梗死后偏瘫肢体功能的恢复，下调nogoa和ngr的表达可能是其促进偏瘫肢体功能恢复的机制之一。电刺激，特别是双侧电刺激可望为脑梗死患者的康复提供可行的治疗方法。
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