【摘要】 目的 观察sirnaid1转染人肝癌细胞hepg2细胞后对肝癌细胞系hepg2细胞增殖的影响及其对erk1/2通路的作用。 方法 实验分为4组，即空白对照组、转染试剂组、转染对照组及转染sirnaid1组。阳离子脂质体法介导siid1转染肝癌细胞后，唑蓝比色法(mtt)观察hepg2细胞增殖情况。分别用反转录聚合酶链式反应法(rtpcr)和蛋白免疫印迹法(western blotting)检测转染后perk1/2、erk1/2 mrna与蛋白表达的情况。 结果 转染sirnaid1的hepg2细胞增殖速度明显减慢(p<0.01)。转染后erk1/2及perk1/2 mrna表达降低(p<0.01);perk1/2蛋白的表达较空白对照组明显降低(p<0.05)，erk1/2蛋白表达空白变化不明显。 结论 sirnaid1转染hepg2细胞后可明显抑制细胞的增殖，使得erk1/2基因表达活性下降，提示id1有可能通过erk1/2信号转导通路介导,促进肝细胞癌hepg2细胞的增殖。
【关键词】 抑制因子，免疫; 丝裂原激活蛋白激酶类; 细胞外信号调节map激酶类; 肝肿瘤; 转染; 信号传导; 氮蓝四唑; rna，小分子干扰
近期发现，丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, mapk)信号途径的激活可能是dna结合抑制因子1(inhibitor of differentiation/dna binding1, idl)诱导细胞增殖的一个机制[1]。wwW.11665.cOm与正常组织相比较，肝癌组织中的mapk通路上的细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase, erk)都是处于高表达及高活性状态。若使用其erk抑制剂就可以减缓细胞的增殖及引起细胞的凋亡[2]。本研究通过小分子干扰rna技术使id1基因沉默，观察其对hepg2细胞增殖的影响及其对erk1/2 mrna及蛋白表达的影响，探讨erk1/2及其信号转导途径与肝癌发生发展的关系。
1 材料和方法
1.1 材料 人肝癌细胞株hepg2细胞(上海科学院细胞中心);sirna试剂(广州锐博生物有限公司);四甲基偶氮唑蓝(mtt，厦门泰京生物有限公司);逆转录聚合酶链反应(rtpcr)试剂盒(美国fermentas公司);pcr引物由上海鼎安生物科技有限公司合成;兔抗人erk1/2多克隆抗体，兔抗人perk1/2多克隆抗体，辣根过氧化酶 (hrp)标记的羊抗兔igg(美国santa cruz公司)。
1.2 分组 分为4组，即空白对照组(正常培养hepg2细胞组);转染试剂组(即仅加入lipofectamine 2000组;转染对照组(即转染非特异性序列control sirna组);转染sirnaid1组。
1.3 方法
1.3.1 sirna的设计和合成 sirnaid1由广州市锐博生物科技有限公司设计合成。
靶序列：5’tgagcaaggtggagattct3’
正义链：5’ugagcaagguggagauucu dtdt3’
反义链：3’dtdt acucguuccaccucuaaga5’
1.3.2 细胞的培养与转染 细胞常规培养于含10%胎牛血清(fbs)的rpmi 1640培养基，于37 ℃、体积分数为0.05的co2培养箱中培养。取对数生长期细胞，用含10%胎牛血清的rpmi 1640培养基(无抗生素)将消化后的hepg2细胞制备成细胞悬液;调整细胞浓度为1×107 l-1，接种于细胞培养板内(6孔加入2 ml，每孔2×104细胞)，培养24 h。参照说明书建议，将sirna浓度稀释为50 nmmol/l，阳离子脂质体法介导sirnaid1转染肝癌细胞。存放24 h后备检测。
1.3.3 mtt法测定细胞增殖 将对数生长期细胞接种于96孔板，每组设4个复孔，分别于培养24，48，72，96 h后;每孔加入20 μl mtt(5 g/l)，继续培养4 h。弃去上清，每孔加二甲基亚砜(dmso)150 μl，平板摇床震摇10 min，酶联免疫检测仪测定490 nm处的吸光度(od值)。
细胞增殖抑制率=(空白对照组od值-实验组od值)/空白对照组od值
1.3.4 rtpcr检测erk1/2及perk1/2 mrna的表达水平 用trizol提取总rna，反转录成cdna。(1)内对照β肌动蛋白(βactin)，扩增片段556 bp;循环条件：4 ℃预变性5 min，扩增94 ℃ 30 s→57 ℃ 30 s→72 ℃ 45 s，30个循环，最终延伸72 ℃ 7 min。
上游：5’aaa gac ctg tac gcc aac acag3’
下游：5’ttt tag gat ggc aag gga ctt c3’
(2)erk1/2扩增片段320 bp;循环条件：预变性5 min，扩增94 ℃ 30 s→59 ℃ 30 s→72 ℃ 30 s，30个循环，最终延伸72 ℃ 7 min。
上游：5’tac acg cag ttg cag tac atc g3’
下游：5’cgc agg atc tgg tag agg aag t3’
(3)perk1/2扩增片段248 bp;循环条件：94 ℃预变性5 min，扩增94℃ 30 s→55 ℃ 30 s→72 ℃ 30 s，30个循环，最终延伸72 ℃ 7 min。
上游：5’gga gct tgt gga aat acc ttg g3’
下游：5’gac gca gtg ttc ctc tct gct a3’
pcr扩增产物用凝胶图像分析系统进行灰度扫描。
1.3.5 western blot法检测erk1/2及perk1/2蛋白的表达水平 细胞总蛋白的提取，采用biorad dc protein assay试剂盒测定蛋白浓度，进行sds聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳条件：110 v，约2 h。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜，利用预染蛋白标准判断，让目的条带跑过分离胶的1/3。电泳结束后，电转移法将蛋白从凝胶中转移到硝酸纤维膜上，将硝酸纤维素膜置于含5%脱脂奶粉的tbst中，室温封闭1 h。将膜erk1/2抗体(1∶800)或perk1/2抗体(1∶1 000)4 ℃孵育过夜。将膜与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔igg(1∶6 000)室温摇晃1 h，硝酸纤维膜用化学发光试剂盒处理并在暗室显影、定影，最后进行凝胶图像分析。
1.4 统计学处理 数据以x±s表示，采用spss 13.0统计软件进行分析处理，组间比较用方差分析(oneway anova)及lsd检验，以p<0.05表示差别有统计学意义。
2 结 果
2.1 sirnaid1转染后hepg2细胞的增殖活性变化 转染sirnaid1对hepg2细胞增殖有明显抑制作用，增殖抑制率明显高于转染对照组、转染试剂组(p<0.01);且转染对照组与转染试剂组间的差别无统计学意义(p>0.05，表1)。表1 hepg2 4组细胞转染后细胞吸光度值
2.2 半定量rtpcr检测结果 hepg2细胞中erk1/2及perk1/2 mrna在正常培养条件下均存在表达;与转染对照组、转染试剂组及空白对照组相比，转染sirnaid1后erk1/2及perk1/2 mrna水平均被有效抑制。
2.3 rna干扰后erk1/2及perk1/2蛋白表达 转染sirnaid1后，转染sirnaid1组的细胞perk1/2蛋白表达明显低于转染对照组、转染试剂组及空白对照组。imageproplus图像分析显示，sirnaid1组细胞perk1/2蛋白的表达较其余3组降低，差别具有统计学意义(p<0.05)，而erk1/2蛋白的表达变化不明显。
3 讨 论
mapk系统是细胞内的一簇丝/苏氨酸蛋白激表2 sirna转染24 h后erk1/2与perk1/2 mrna表达情况
tab 2 the results of erk1/2 and perk1/2 mrna after transfection 24 hours分 组erk1/2/βactinperk1/2/βactin空白对照组0.63±0.110.78±0.12转染试剂组0.70±0.100.83±0.13转染对照组0.68±0.050.75±0.11转染sirnaid1组0.18±0.02☆☆0.25±0.03☆☆ n=4. 与空白对照组比较，☆☆：p<0.01.
酶，erk包括erk1和erk2，是mapk家族的重要成员[34]。erk1/2是由boulton等于1990年代初期先后分离鉴定的一种蛋白激酶，相对分子质量分别为44 kd和42 kd，具有90%的同源性。erk1/2为脯氨酸导向的丝氨酸/苏氨酸激酶，可以 a：ekr1/2;b:perk1/2. 1.空白对照组;2.转染试剂组;3.转染对照组;4.转染sirnaid1组.
图1 rtpcr法检测rna干扰24 h后hepg2细胞erk1/2与perk1/2 mrna的表达
fig 1 effects of sirna on erk1/2 and perk1/2 mrna expression in hepg2 cells by rtpcr
n=4. a：rna干扰24 h后hepg2细胞erk与perk1/2蛋白电泳图. 1：空白对照组;2：转染试剂组;3：转染对照组;4：转染sirnaid1组. b：rna干扰24 h后hepg2细胞erk与perk1/2蛋白含量表达. 与空白对照组比较，☆☆：p<0.05.
使脯氨酸相邻的丝氨酸/苏氨酸磷酸化。erk1/2的活化是将信号从细胞膜表面受体转导至核的关键。其活化的中心是使ras进行鸟苷酸交换变成其活化形式rasgtp。erk1/2是ras通路中重要的信号分子，位于ras的下游，主要由生长因子受体(或蛋白质酪氨酸激酶受体)介导激活，并需要ras，pkc和raf蛋白参与。平时erk位于细胞质内，一旦被激活，即发生磷酸化，磷酸化的erk迅速穿过核膜，再激活转录因子或/和p70核蛋白体s6激酶。pd98059是erk1/2信号转导途径的抑制剂，它可以结合 erki/2并使其失活，阻止raf对erk1/2的磷酸化和激活[56]。由于erk通过磷酸化反应可调节某些转录因子的活性，如eikl，cmyc，stats，jun，fos，atf2和max等，这些转录因子进一步调节它们各自靶基因的转录，引起特定蛋白的表达或活性改变，最终调节细胞代谢和功能，影响细胞产生特定的生物学效应，例如调控细胞增殖、凋亡与侵袭等，是各种各样细胞外刺激信号引起细胞增殖分化的细胞内信息传递的共同通路或交汇点[78]。研究表明，异位表达id1的前列腺癌细胞lncap中，mapk途径的几个关键性调节因子，如raf和mek1/2磷酸化形式的增加，可能导致idl的表达[9]。另一研究也发现id1可能通过激活mapk途径诱导肿瘤细胞增殖[10]。kim等研究显示，通过激活erk1/2信号通路，可提高id1诱导人脐带内皮细胞和乳腺癌细胞株mcf7低氧诱导分子1a的稳定性和活性，进而诱导微血管的形成及vegf表达，参与调节肿瘤血管发生，他们都认为id1、erk1/2对人类多种肿瘤细胞的发生和进展有着及其重要的作用[11]。大量研究表明，id1在促进肝癌细胞hepg2增殖和抑制细胞凋亡的发挥重要作用，是肿瘤发生、发展过程中的正调节蛋白。而rnai技术以其高效、稳定、高特异性等特点，已成为肿瘤基因治疗的新的研究热点。前期笔者做过实验，证实sirnaid1转染入肝癌hepg2细胞后id1基因的表达以及肝癌细胞的增殖受到明显的抑制。此次试验结果表明，sirnaid1转染入肝癌细胞hepg2后细胞的增殖明显受抑制，转染实验组和转染对照组、转染试剂组及空白对照组之间的比较具有统计学意义(p<0.01)，这和转染sirna后细胞周期进程的抑制是相符合的。另外，24 h后rtpcr检测erk1/2及perk1/2 mrna表达降低(p<0.01)，而转染对照组、转染试剂组及空白对照组的erkl/2及perk1/2 mrna比较差别无明显意义，该结果表明，sirnaid1可有效沉默erkl/2及具有活性的perkl/2 mrna表达。western blotting检测进一步证实，转染实验组perk1/2蛋白的表达较转染对照组、转染试剂组及空白对照组明显降低(p<0.05)，而erk1/2蛋白表达变化不明显，这说明了非活性状态的erk1/2蛋白表达不受或受影响不明显，而活性状态的erk1/2表达则明显降低，由此推测，只有perk1/2表达降低，才能抑制某些转录因子的活性，进而使得特定蛋白的表达降低，最终影响细胞增殖、代谢和功能。说明应用rna干扰靶向抑制id1基因可进一步的阻滞erk1/2通路的激活。因此，有理由推测id1和erk1/2基因在促进肿瘤细胞增殖中有着协同效应，以及id1在肝癌细胞中的表达和erk1/2信号通路的活性有一定的相关性，erk1/2信号通路有可能参与id1促进肿瘤细胞的增殖。
【参考文献】
[1] lee k h,choi e y,hyun m s, et al. cellular mechanisms of hepatocyte growth factormediated urokinase plasminogen activator secretion by mapk signaling in hepatocellular carcinoma[j]. tumori, 2008,94(4):523530.
[2] cusimano a,foder d,d'alessandro n, et al. potentiation of the antitumor effects of both selective cyclooxygenase1 and cyclooxygenase2 inhibitors in humanhepatic cancer cells by inhibition of the mek/erk pathway[j]. cancer biol ther, 2007,6(9):14611468.
[3] hagemann c,blank j l. the ups and downs of mek kinase interactions[j]. cell signal, 2001,13(12):863875.
[4] chang l,karin m. mammalian jan map kinase signaling cascades[j]. nature, 2001,410(6824):3740.
[5] boulton t g,nye s h,robbins d j, et al. erks: a family of porteinserine/threonine kinases thatrae activated and tyrosinephosphoyraltde in response to insulin and ngf[j].cell, 1991,65(4):663675.
[6] boulton t g,yancopoulos g d,gregory j s, et al. an insulinstimualted protein kinase similar to yeast kinases involved in cell cycle control[j]. sceinces, 1990,249(4964):4667.
[7] rice p l,goldberg r j,ray e c, et al. inhibition of extracellular signalregulated kinase 1/2 phosphorylation and induction of apotosis by sulindac metabolites[j]. cancer res, 2001,61(4):15411547.
[8] ajenjo n,aaronson d s,ceballos e, et al. myeloid leukemia cell growth and differentiation are independent of mitogenactivated protein kinase erk1/2 activation[j]. j biol chem, 2000,275(10):71897197.
[9] lee k t,lee y w,lee j k. overexpression of id1 is significantly associated with tumor angiogenesis in human pancreas cancers[j]. br j cancer, 2004,90(6):11981203.
[10] ling m t，wang x，ouyang x s，et al.activation of mapk signaling pathway is essential for id1 induced serum independent prostate cancer cell growth[j].oncogene，2002，21(55)：84988505.
[11] kim h j,chung h,yoo y g, et al. inhibitor of dna binding 1 activates vascular endothelial growth factor through enhancing the stability and activity of hypoxiainducible factor1 alpha[j]. mol cancer res, 2007,5(4):321329.
