rna干扰survivin基因对hepg2细胞凋亡及化疗影响
【关键词】 肝肿瘤;survivin;rna干扰;药物疗法
【摘要】 目的 探讨rna干扰survivin基因对hepg2细胞凋亡及化疗敏感性的影响。方法 构建针对hepg2细胞 survivin基因的 shrna真核表达载体pshrnasurvivin387。将hepg2细胞接种于6孔板中，分为空白对照组(不加药物)、阴性对照组(每孔加pshrnasurvivinnc为3.2 μg)、低浓度转染组（每孔加pshrnasurvivin387为0.8 μg）、中浓度转染组(每孔加pshrnasurvivin387为1.6 μg)、高浓度转染组(每孔加pshrnasurvivin387为3.2 μg),作用48 h后收集细胞，流式细胞术检测各组细胞凋亡指数；将hepg2细胞接种于96孔板中，分为3组:空白对照组（不加药物）、阴性对照组（每孔加pshrnasurvivinnc为0.2 μg）、实验组（每孔加 pshrnasurvivin387为0.2 μg），四甲基偶氮唑蓝法检测各组细胞分别与顺铂(2.0 mg/l)作用24、36、48、60 h后的增殖水平。结果 各浓度转染组细胞的凋亡指数明显高于空白对照组和阴性对照组(f=228.87，q=10.45～38.21,p＜0.01)，高浓度转染组细胞凋亡指数高于低浓度转染组(q=23.99，p＜0.01)。wWw.11665.CoM顺铂对实验组细胞的细胞抑制率在24、36、48、60 h时明显高于空白对照组和阴性对照组(f=235.88～910.86,q=28.04～52.28,p＜0.01)。结论pshrnasurvivin387转染能诱导肝癌细胞的凋亡，增强肝癌细胞对顺铂化疗的敏感性。
【关键词】 肝肿瘤;survivin;rna干扰;药物疗法
effect of rna interference targeting at survivin gene on apoptosis and chemotherapy of hepatocellular carcinoma cell line hepg2
sun yao, lei wei
(department of oncology, the affiliated hospital of qingdao university medical college, qingdao 266003, china) ;
［abstract］ objective to investigate the effect of rna interference targeting at survivin gene on the apoptosis and chemosensitivity of hepatocellular carcinoma cell line hepg2. methods survivin gene sequence specific shrna vectors pshrnasurvivin387 were constructed. hepg2 cells cultured in 6well culture dish were divided into five groups: blank control group (without any drug), negative control group(3.2 μg pshrnasurvivinnc 3/well), lowdose group(0.8 μg pshrnasurvivin387/well), mediumdose group (1.6 μg pshrnasurvivin387/well) and highdose group(3.2 μg pshrnasurvivin387/well). after 48 h of transfection, cultured cells were harvested, and the apoptotic index was examined by flow cytometry. hepg2 cells cultured in 96well culture dish were divided into three groups：blank control group (without any drug), negative control group (0.2 μg pshrnasurvivinnc/well), and pshrnasurvivin387 group (0.2 μg pshrnasurvivin387/well). mtt assay was used to detect the rate of cellular inhibition effected by cddp (2.0 mg/l) after 24, 36, 48 and 60 hours. results the apoptotic index of the low, medium and highdose pshrnasurvivin387 groups were significantly higher than those of the blank control group (f=228.87,q=14.21-38.21,p＜0.01) and those of the negative control group (q=10.45-34.40,p＜0.01). apoptotic index of highdose pshrnasurvivin387 groups were significantly higher than that of the lowdose pshrnasurvivin387 groups (q=23.99,p＜0.01). the rate of inhibition of cddp in pshrnasurvivin387 groups were significantly higher than those of the control groups (f=235.88-910.86,q=28.04-52.28,p＜0.01). conclusion transfection of the pshrnasurvivin387 to hepg2 cell can induce the apoptosis of liver cancer cells, and increase the sensitivity of the cells to chemotherapy.
［key words］ liver neoplasms; survivin; rna interference; drug therapy
survivin基因是凋亡蛋白抑制因子(iap)家族成员，其基因定位于人染色体17q25，长度15 kb,其表达蛋白约由142个氨基酸构成。survinvin在成熟分化组织中基本不表达，而在肿瘤组织中特异性高表达，具有抑制细胞凋亡、参与血管形成的功能，从而作为肿瘤基因治疗靶点受到广泛瞩目。rna干扰 (rnai)即将与目的基因同源的小分子双链rna(dsrna)导入细胞中，导致目的mrna降解，从而阻断真核细胞中相应基因产物的表达。本实验利用rnai技术阻断人肝癌hepg2细胞survinvin的表达，并观察其对细胞凋亡及化疗敏感性的影响。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂
lipofectamine 2000转染试剂盒购自invitrogen公司;胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料公司；rpmi 1640培养液由gibco公司提供；四甲基偶氮唑蓝（mtt）由美国sigma公司提供；optimem i优化培养基由invitrogen公司提供。
1.1.2 细胞株的培养
人肝癌hepg2细胞由我院肿瘤科实验室获取，在含体积分数0.10胎牛血清的rpmi 1640培养液中，置温度37 ℃、含体积分数0.05 co2培养箱中培养。
1.2 方法
1.2.1 重组质粒的构建
根据rna设计原则和survivin（nm_001168） 编码序列，利用blast 进行查询，并根据前期实验的结果[1],确定并特异性设计合成1对survivin 编码序列的sirna 片段,构建survivin 基因的重组载体pshrnasurvivin387，设计基因靶点位于survivin基因序列的第387位点,靶基因序列为:5′gaaagtgcgccgtgccatc3′。 合成的dna两端设计有bam hi或bbs ⅰ酶切位点，便于与pgph1/gfp/neo载体连接。
pgph1/gfp/neo载体结构如图1所示。另设阳性对照表达载体pshrnasurvivingapdh及阴性对照表达载体pshrnasurvivinnc，以上载体由上海吉玛制药公司构建。
1.2.2 细胞分组和转染
取处于对数生长期的hepg2，传代接种于6孔板，调整细胞密度使每孔细胞数约1×105个，在37 ℃、含体积分数0.05 co2培养箱中培养24 h，显微镜下观察细胞融合达70%～80％时开始实验。设置阴性对照组(每孔加pshrnasurvivinnc为3.2 μg)、低浓度转染组（每孔加pshrnasurvivin387为0.8 μg）、中浓度转染组(每孔加pshrnasurvivin387为1.6 μg)、高浓度转染组(每孔加pshrnasurvivin387为3.2 μg)。每组设5个复孔，转染过程按照lipofectamine 2000转染试剂盒说明书进行。
1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡率
制备1×106个细胞悬浊液，置体积分数0.70乙醇中4 ℃固定过夜，离心去上清，细胞重悬于0.4 ml的pbs中，加5 g/l rnasea 10 μl，37 ℃处理1 h,加溴化丙啶染色液，4 ℃染色过夜。应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.2.4 mtt法检测顺铂最佳有效浓度
取对数生长期的hepg2细胞，接种于96孔板，分为4组，分别加入浓度为0.5、1.0、2.0、4.0 mg/l的顺铂，每组设5个副孔，作用36 h后每孔再加入10 μl mtt(5 g/l，应用无血清rpmi 1640 配制,过滤除菌) 于37 ℃培养箱中培养4 h后终止培养, 每孔加入dmso 150 μl,振荡10 min,以便结晶充分溶解，酶标仪检测490 nm 处各孔吸光度(a)值。化疗药物对细胞生长抑制率(ir)。ir=(1-化疗药物实验孔a值)／空白对照孔a值×100％。
1.2.5 mtt法检测顺铂作用的转染后hepg2的细胞生长抑制率
将hepg2细胞分为空白对照组（不加入药物）、阴性对照组（每孔加入pshrnasurvivinnc为0.2 μg）、实验组（每孔加入pshrnasurvivin387为0.2 μg），接种于96孔板，每组设5个复孔, 转染过程按照lipofectamine 2000转染试剂盒说明书进行。转染后36 h,将细胞培养基更换为顺铂浓度为2.0 mg/l，含体积分数0.10胎牛血清、不含抗生素的rpmi 1640培养基，分别作用24、36、48、60 h后，每孔加入10 μl的mtt(5 g/l，用无血清rpmi 1640 配制,过滤除菌) 置于37 ℃培养箱中培养4 h后终止培养, 每孔加入dmso 150 μl,振荡10 min, 以便结晶充分溶解，酶标仪检测490 nm 处各孔吸光度（a）值。计算细胞生长抑制率。
1.3 统计学分析
使用spss 11.5及ppms 1.5[2]统计学软件进行数据处理，结果以±s表示，多组间比较采用f检验，两两比较采用q检验。
2 结果
2.1 pshrnasurvivin387转染对hepg2细胞凋亡的影响
pshrnasurvivin387转染可诱导hepg2细胞凋亡，各浓度转染组的细胞凋亡指数均明显高于阴性对照组和空白对照组（f=228.87，q=10.45～38.21,p＜0.01），且以高浓度转染组凋亡诱导作用最为明显。见表1。表1 转染48 h后各组hepg2细胞凋亡指数比较（略）
2.2 不同浓度顺铂对hepg2细胞生长抑制作用
不同浓度（0.5～4.0 mg/l）的顺铂对hepg2细胞生长均有抑制作用，顺铂浓度为2.0 mg/l时的细胞生长抑制作用最强，各组间比较，差异有显著性（f=192.35，q=12.01～28.50,p<0.05）。顺铂浓度超过2.0 mg/l后，随药物浓度的增加细胞的生长抑制作用未有增强。见表2。表2 不同浓度顺铂作用下hepg2细胞的生长抑制率（略）
2.3 pshrnasurvivin387转染对hepg2细胞顺铂敏感性的影响
等浓度的化疗药物顺铂对转染后hepg2细胞的生长抑制率明显高于阴性对照组和空白对照组，且随时间的延长细胞生长抑制作用增加，差异有显著性(f=235.88～910.86,q=19.35～57.98，p＜0.01)。见表3。表3 顺铂作用后不同时间各组hepg2的生长抑制率（略）
3 讨论
survivin是近年来发现的一种凋亡抑制基因，属于凋亡抑制蛋白家族的新成员。王滋宗等[3]、靳秋月等[4]研究结果显示，在非小细胞肺癌细胞、结肠癌细胞中caspase3 基因的表达与survivin基因表达具有显著负相关性，说明survivin 与抑制肿瘤细胞的凋亡相关。morinaga等[5]研究证实了survivin高表达与肝癌发生密切相关。因此，靶向封闭survivin可诱导肝癌细胞凋亡并抑制细胞增殖,从而抑制肿瘤细胞生长[6]。rnai是利用dsrna 特异性介导其互补同源mrna 序列的降解从而阻断细胞中相应基因产物的表达。根据这一原理，依照靶基因mrna设计序列特异性sirna，可起到封闭特异性基因表达的作用[7]。因此，本课题设计通过rnai技术下调survivin 表达以影响肝癌的治疗，构建发卡样rna(shrna)真核表达载体,其转录产物可在体内形成由一个茎环所分离的有反向重复序列的shrna,此shrna 随后被加工成sirna 而降解目的基因mrna 表达。前期实验已证明了pshrnasurvivin387 能有效地降解hepg2细胞内的mrna, 使mrna 水平下降[1]。本实验在此基础上探讨sirna下调hepg2细胞survivin 表达对细胞凋亡以及化疗药物敏感性的影响。实验结果显示，不同浓度转染组凋亡率均高于阴性对照组和空白对照组，且以高浓度转染组凋亡率最高。说明survivin 表达率越低，hepg2细胞凋亡率越高。提示采用基因技术封闭survivin表达，可以解除survivin对凋亡的抑制作用，诱导肿瘤细胞凋亡，从而达到治疗的目的。肝癌在传统临床治疗中不敏感，对化疗耐药。肿瘤细胞凋亡机制的缺陷是耐药性产生的关键因素之一。对细胞凋亡机制的修复可提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，克服耐药性的产生。本文实验结果表明，转染后hepg2细胞在顺铂作用后增殖水平明显低于阴性对照组，survivin下调表达提高了顺铂的敏感性。提示survivin表达引起的hepg2细胞凋亡机制的缺陷在一定程度上参与了肝癌细胞对化疗耐药性的产生，rnai抑制survivin表达可一定程度抑制细胞耐药性的产生。这也与王颖等[8]、陈科济等[9]的研究结果相一致。因此，本实验为pshrnasurvivin抑制肿瘤细胞内源survivin基因的表达从而介导肿瘤细胞的凋亡、提高化疗敏感性提供了可行性方案。survivn有望成为肝癌治疗的新靶点，可进行进一步研究从而将其应用到临床实践中。
【参考文献】
[1] 杨敬敬,雷炜,于壮. rna干扰survivin基因对人肝癌hepg2细胞增殖的影响[j]. 齐鲁医学杂志, 2009,24(3):199121.
[2] 周晓彬,纪新强,徐莉. ppms统计软件的功能及其应用[j]. 青岛大学医学院学报, 2009,45(1):9193.
[3] 王滋宗,魏煜程,沈毅,等. 非小细胞肺癌组织survivin 和caspase 基因表达及其关系[j]. 青岛大学医学院学报, 2008,44(4):319321.
[4] 靳秋月,陈立军,呼文亮. caspase3在survivin反义寡核苷酸诱导人结肠癌细胞ht29凋亡时的表达[j]. 天津医药, 2007,35(9):649651.
[5] morinaga s, nakamura y, ishiwa n, et al. expression of survivin mrna associates with apoptosis, proliferation and histologically aggressive features in hepatocellular carcinoma[j]. oncol rep, 2004,12(6):11891194.
[6] 高鹏,张刚庆,颜政. survivin反义寡核苷酸抑制肝癌移植瘤生长的作用[j]. 世界华人消化杂志, 2006,14(16):16271630.
[7] filipowicz w, jaskiewicz l, kolb f a, et al. posttranscriptional gene silencing by sirnas and mirnas[j]. curr opin struct biol, 2005,15(3):331341.
[8] 王颖,蔡钢祥,吴亮,等. 靶向survivin基因 sirna诱导肝癌细胞凋亡的实验[j]. 医药导报, 2006,25(7):648651.
[9] 陈科济,王义,孙延富. 肝癌细胞survivin表达及其与化疗药物顺铂敏感性的关系[j]. 肝胆胰外科杂志, 2009,21(1):46.
