作者：朱碧云，高蓝，黄欣，李浩明
【摘要】 目的 构建红曲霉cdna文库，为红曲霉功能基因的研究以及筛选、克隆红曲霉次生代谢产物合成途径相关基因奠定基础。方法 采用smart(switching mechanism at 5′end of rna transcript)技术构建红曲霉全长cdna文库， 经涂平板和酶切反应测定文库的克隆数、重组率，pcr测定插入片断的大小。结果 原始文库的库容为2.03×105，重组率达94%。插入片段大小多在0.7～2.0 kb，平均大小在1 kb左右。结论 所构建文库的代表性和重组片段的序列完整性达到了用于目的基因的分离筛选和克隆表达的建库要求。
【关键词】 红曲霉菌 cdna文库 smart
abstract:objective construction of monascus cdna library provide foundations for the research of monascus functional genes and screening,cloning genes related to the synthesis pathway of secondary metabolites in monascus.methods a cdna library was constructed based on smart system. the number of the clones and the recombination rate of the library were determined by plate coating and restrictive digestion,and the size of inserted fragment was determined by pcr. results the primary library capacity was 2.03×105，average inserted fragment size was about 1 000 bp and the percentage of recombination were 94%. conclusion the library met the requirement for cloning target genes and expressing target proteins.
key words: monascus; cdna library; smart
红曲霉菌(monascus)是我国重要的微生物资源，其应用已有上千年的历史。wWW.11665.COM红曲菌在发酵过程中能产生多种重要生物活性物质，具有降血脂、降血压、抗氧化、抗癌、抗菌、防治骨质疏松和保护肝脏等多重功效。明代李时珍的《本草纲目》中记载了红曲的药用价值——“消食活血，健脾燥胃，治赤白痢下水谷，酿酒，破血行药势，杀山岚瘴气，治打扑伤，治女人血气痛及产后恶血不尽，擂酒饮之，良。” 红曲霉的早期研究主要集中于其所产的红曲色素和各种酶类，如淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、果胶酶等，因此早期红曲霉主要用于食品着色、酿酒、食品发酵等。1979年日本学者endo[1]从泰国出产的红曲米中分离筛选出具有降脂作用活性成分monacolin k(又称lovastatin，洛伐他汀)的红曲霉之后，对红曲功能食品的研发活跃起来，我国相继开发出“血脂康”、“脂必妥”等多种红曲功能食品[2]，moncolin k生物合成相关基因也被克隆与分析[3]，红曲霉的研究进入分子水平。
全长cdna文库的构建、测序和功能注释是了解生物体结构和功能的一种重要方法之一[4]。全长cdna有助于鉴定其基因组序列中的外显子内含子的边界，分析基因编码区和理解基因在转录和翻译水平的功能，是分析真菌基因表达图谱、功能和结构的重要资源。构建cdna文库已成为研究功能基因组学的基本手段之一，在分离、克隆、筛选新基因以及基因功能研究等方面具有重要作用。本文利用smart方法构建了红曲霉全长cdna文库,为进一步开发利用红曲霉奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
安卡红曲霉(monascus anka)cicc 5031，由中国工业微生物菌种保藏中心保存;trizol提取试剂购自美国invitrogen公司;creator smart cdna文库构建试剂盒购自美国clontech公司;质粒小量提取试剂盒、pcr taq mix试剂盒购自广州东盛生物科技有限公司;其他生化试剂购自国内生物公司。
1.2 方法
1.2.1 总rna提取
接种红曲霉于土豆培养基(pdl)中，30 ℃，170 r/min，培养5 d至产生红曲色素。将菌液离心，沉淀分别用蒸馏水、无菌水、depc水润洗，干燥，称干重，将样品放于研钵中，加入液氮，研磨至粉状。在样品未融化前加入trizol reagent，继续研磨使样品溶解。离心，取上清。加氯仿，摇匀，离心，取上清。加异丙醇沉淀rna。75%(φ)乙醇洗涤沉淀，风干rna，用无rnase水溶解沉淀，-70 ℃保存。得总rna。使用紫外分析仪检测总rna浓度、纯度，1.1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。
1.2.2 双链cdna的合成
广东药学院学报 第25卷 第3期 朱碧云，等.smart技术构建红曲霉全长cdna文库 在5 μl反应体系中加入1.0 μg total rna、smart ⅳ oligonucleotide (5′aagcagtggtat caacgcagagtggccattacggccggg3′) 1 μl、cds ⅲ/3′pcr引物[5′attctagaggccgag gcggccgacatgd(t)30 n-1n3′( n=a、g、c or t;n-1=a、g or c] 1 μl，用无rnase水补足到5 μl。混匀，短暂离心，72 ℃，2 min;冰上冷却2 min，短暂离心;向反应液中加入5×第一链反应缓冲液2.0 μl及20 mmol/l dtt、10 mmol/l dntp混合液、mmlv逆转录酶各1 μl于42 ℃孵育60 min，置于冰浴中终止反应。取2 μl第一链产物于干净预冷0.2 ml反应管中，进行pcr扩增。引物为5′pcr引物(5′aagcagtggtatcaacgcagagt3′)、cdsⅲ/3′pcr引物。循环条件为：首先把pcr仪预热到95 ℃，再20个循环：95 ℃ 15 s，68 ℃ 6 min。1.1%琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，并估算其浓度。
1.2.3 cdna 的分级分离纯化及文库构建
合成的双链cdna经蛋白酶k消化及sfiⅰ酶切后，柱层析分级，共收集15管，每管取3 μl进行1.1%琼脂糖电泳检测，合并能显示亮带的前4管(片段>0.4 kb)，进行沉淀，重悬在去离子水中，加t4dna连接酶，与质粒载体pdnrlib(经sfiⅰ酶处理过)于16 ℃下连接过夜。cdna与载体的比例为1.5∶1。连接产物经电击转化大肠杆菌dh5α感受态细胞。电击条件：电击杯内径0.1 cm，电容25 μf，电阻200 ω，电压1.8 kv，感受态25 μl,电转仪：biorad gene pulser xcell 电穿孔仪。将转化产物转移到加有1 ml lb培养基的试管中，225 r/min，37 ℃，培养1 h。
1.2.4 原始文库质量鉴定
取适量原始文库菌液，均匀地涂在含30 μg/ml氯霉素的lb平板上，随机挑取15个克隆，提取质粒经sfiⅰ酶切后电泳检测，可测定其重组率及重组片段的大小。文库的扩增采用涂平板培养扩增。取适量原始文库均匀地涂在10个含30 μg/ml氯霉素的lb平板，37 ℃倒置培养过夜，用含有25%(φ)甘油lb培养基洗脱所有的菌落，2 ml/板，将每板的洗脱液混合摇匀即得到了扩增文库，检测其滴度，分装，放置-80 ℃保存。
2 结果分析
2.1 总rna提取
提取的样品总rna经紫外分光光度计测定，a260/a280值为1.77，表明所得总rna纯度较高，但稍有降解。1.1%琼脂糖凝胶电泳结果显示(图1)，28 s rrna、18 s rrna和5.8 s rrna三条特征条带清晰，表明总rna比较完整，也没有明显的基因组dna污染。
2.2 双链cdna的合成及分级
合成的双链cdna产物的1.1%琼脂糖凝胶电泳结果显示，成一弥散带，最大片段超过10 kb，主要集中在0.5～2.5 kb (图2 )，表明合成的cdna是比较完整的。由于较小的非全长cdna片断更容易连接进载体，所以需要对经过蛋白酶k处理和sfiⅰ酶切后的cdna进行分级分离，以去除较小的cdna片断和引物片断。采用chroma spin400柱分级分离，共收集15管洗脱液(图3 )。根据1.1%脂糖凝胶电泳检测结果，合并合适大小片段的收集管样品(6～9管)，乙醇沉淀，重悬于去离子水中。
2.3 文库质量的检测及扩增
经涂平板检测方法得到的结果：文库的库容为2.03×105。随机挑取10个克隆，在2 ml lb培养基中37 ℃，225～250 r/min，摇床培养过夜。取1 ml菌液，使用质粒小量提取试剂盒提取质粒，得50 μl质粒产物。在25 μl反应体系中加入1 μl质粒产物，m13+与m13-各0.5 μl，2×taq mix 12.5 μl,其余用pcr超纯水补足。循环条件为：94 ℃ 3 min，30个循环：94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，然后再72 ℃ 10 min。以剩余菌液为模板做菌落pcr，将菌液离心，用牙签沾取沉淀放入加了50 μl无菌水的反应管中，95 ℃裂解5 min。在25 μl反应体系中加入2.5 μl裂解液，m13+与m13-各1.0 μl，2×pcr taq mix 12.5 μl，pcr超纯水8.0 μl。循环条件为：94 ℃ 3 min，35个循环：94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，然后72 ℃ 10 min。琼脂糖凝胶电泳，结果表明，每个克隆均有插入片段，重组率94%，插入片段大小大多在0.7～2.5 kb之间，平均大小在1 kb左右(图4)。文库的重组片段大小适合以后的测序及功能基因的研究。 扩增文库的总容量达到2.03×105，适合长期保存。另随机抽取6个菌落送去北京华大基因公司测序：有5个有片段插入， 长度分别为 h1： 1 055 bp; h2： 644 bp; h4：1 948 bp;h5：923 bp;h6：1 386 bp。其中h1和h6为蛋白质编码序列，其他为未知序列。
3 讨 论
要成功构建一个全长cdna文库，一个关键问题是要分离得到高质量的rna。而影响总rna质量的因素主要有3个：一是否有降解;二是否有污染(dna、蛋白质、小分子物质);三是否完整,即包括生命体所有基因的转录产物。全长cdna文库的构建是进行分子生物学研究的基本方法之一。它可以很方便地用于分离全长基因以进一步开展基因功能的研究，成功地构建一个全长cdna文库，分离得到高质量的mrna是一个前提，并且得到的mrna种类越多，cdna文库就越完整，这就对rna的质量有较高的要求。本研究所提取的 rna，在琼脂糖凝胶电泳上表现为28 s、18 s、5.8 s三条清晰条带，所提取的rna经紫外检测，a260/a280=1.77，说明所提取的rna较纯，没有蛋白污染。smart技术是近年发展起来的一项利用较少mrna甚至总rna建立cdna文库的方法[ 5-7]。其主要原理是应用5′mart引物得到全长cdna，并利用ld pcr特异扩增全长cdna，排除了不完整的cdna片断，并通过基因组内极其稀有的酶切位点sfiⅰ切割cdna，得到接头并定向连接到载体中，大大提高了效率。
在cdna文库构建完成之后，要对载体中插入片段的大小进行检测，本实验分别以质粒dna、菌落pcr检测后，发现直接作菌落pcr和用质粒dna作模板进行的pcr检测都能得到同样明确的结果，成功地进行了cdna文库的鉴定。插入片段长度在600～2 500 bp之间，且长度并不均一，说明所构建的文库具有一定复杂性。
cdna文库的质量具体反映在两个方面：一是文库的代表性，可用一个量化的指标来衡量，即文库的库容量。本实验所构建的原始cdna文库具有的独立克隆数为2.03×105个，包括了大部分稀有的mrna，可以满足大规模测序所用。二是重组cdna片段的大小。本研究所构建的文库插入片断97%在0.5 kb以上，平均长度为1.0 kb，保证了高比例全长cdna的获得。
本研究运用clontech专利的smart方法,构建了高效的红曲霉全长cdna文库，经滴度测定、重组率、pcr鉴定均符合cdna文库的质量要求，可以对其进行随机挑选克隆测序分析，或利用探针、抗体进行文库的筛选以寻找红曲霉的相关功能基因，为下一步红曲霉功能基因的研究以及筛选、克隆红曲霉次生代谢产物合成途径相关基因奠定基础。
【参考文献】
[1] endo a,monacolin k. a new hypocholesterolemic agent produced by a monascus species[j].j antibiot,1979，32，852-854.
[2] 沈士秀.红曲的研究生产及应用[j].食品工业科技，2001，22(1):85-87.
[3] chen y p,liaw l l,wang c l,et al.monascus pilosus monacolin k biosynthetic gene cluster，complete sequence. direct submission (23aug2005)[db].genbank dq176595.[2005-09-13].
[4] 晏惹君，黄兴奇，程在全.cdna文库构建策略及其分析研究进展[j].云南农业大学学报，2006，21 (1)：1-6.
[5] wellenreuther r，schupp i，poustka a，et al.the german cdna consortium smart amplification combined with cdna size fractionation in order to obtain large fulllength clones[j]. bmc genomics，2004，36(5)：1-8.
[6] chenchik a，moqadam f，siebert p.a new method for fulllength cdna cloning by pcr[m]//krieg p a.a laboratory guide to rna isolation，analysis and snythesis.new york：wileyliss，inc，1996:273-32l.
[7] sehuler g d.pieces of the puzzle：expressed sequence tags and the catalog of human genes[j].j mol med，1997，75：694-698.
[8] 毛新国，景蕊莲，孔秀英.几种全长cdna文库构建方法比较[j]. 遗传，2006，28(7)：865-873.
