低分子肝素对copd大鼠模型肺组织icam1和mcp1表达影响
【关键词】 1肺疾病，慢性阻塞性;肝素，低分子质量;细胞黏附分子;单核细胞化学吸引蛋白质1
【摘要】 目的 观察低分子肝素(lmwh)对慢性阻塞性肺疾病(copd)大鼠模型肺组织细胞间黏附分子1(icam1)和单核细胞趋化蛋白1(mcp1)表达的影响。方法 将wistar大鼠30只随机分为正常对照组、copd模型组、lmwh干预组，每组10只。采用熏吸香烟加气管内注入脂多糖的方法建立copd模型，lmwh干预组于copd模型开始建立时皮下注射lmwh 150 u/kg，每天1次。观察各组肺组织病理改变、血气指标、肺泡灌洗液(balf)的细胞计数及分类，应用免疫组化法测定肺组织icam1、mcp1的表达情况。结果 所建copd模型的病理学改变符合人类copd的特点。与copd模型组比较，lmwh干预组肺组织的病理改变轻，balf中白细胞总数、中性粒细胞数百分比明显下降(f=146.77、106.63，q=10.29、12.42，p<0.01)，肺组织icam1、mcp1的表达明显减弱(f=32.08、56.36，q=6.87、8.68，p<0.01)。结论 icam1和mcp1参与了气道炎症的发生，lmwh可能通过抑制icam1、mcp1表达而减轻copd气道炎症。WWw.11665.COm
【关键词】 肺疾病，慢性阻塞性;肝素，低分子质量;细胞黏附分子;单核细胞化学吸引蛋白质1
effect of low molecular weight heparin on expressions of intercellular adhesion molecular1 and monocyte chemoattractant protein1 in rats with chronic obstructive pulmonary diseasechen xia, tong li, cheng zhaozhong, et al (department of respirology, the affiliated hospital of qingdao university medical college, qingdao 266003, china); [abstract] objective to observe the effect of low molecular weight heparin (lmwh) on expressions of intercellular adhesion molecular1 (icam1) and monocyte chemoattractant protein1 (mcp1) in lung tissue of rats with chronic obstructive pulmonary disease (copd). methods thirty wistar rats were equally randomized to three groups; control group, copdmodel group and lmwhtreated group. a copd model was created by intratracheal instillation of lipopolysaccharide and exposed to cigarette smoking. hypodermic injection of lmwh, 150 u/kg once a day, was offered to the rats in lmwh group, starting from the day upon completion of the model. pathologic changes of the lung tissue, blood gas and the total and differential cell counts of bronchoalveolar lavage fluid in all three groups were determined. the expressions of icam1 and mcp1 were observed immunohistochemically. results the pathological changes in the copd model were coincident with that in human. compared with copdmodel group, pathological changes of the lung tissue in lmwhtreated group were milder, the total white blood cells and the percentage of neutrophils in balf decreased (f=146.77,106.63;q=10.29,12.42;p<0.01), the expressions of icam1 and mcp1 decreased (f=32.08,56.36;q=6.87,8.68;p<0.01) conclusion icam1 and mcp1 involve in the process of airway inflammation, and lmwh relieves the inflammation probably by restraining the expressions of icam1 and mcp1.
[key words] pulmonary disease, chronic obstructive; heparin, low molecular weight; cell adhesion molecules; monocyte chemoattractant protein1
慢性阻塞性肺疾病(copd)是一种以肺部气流受限为特征的疾病。气流受限不完全可逆，呈进行性发展，这种改变与气道炎症密切相关[12]，气道炎症是copd发病的重要机制之一。本研究通过熏吸香烟加气管内注入脂多糖的方法建立copd大鼠模型，应用免疫组化法分别检测支气管肺组织中细胞间黏附分子1(icam1)和单核细胞趋化蛋白1(mcp1)的表达，以探讨二者在气道炎症中的作用及低分子肝素(lmwh)对气道炎症的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
健康雄性wistar大鼠30只，12周龄，体质量(200±20)g，由青岛市药检所动物实验中心提供;lmwh(法安明，辉瑞比利时公司);脂多糖(lps，美国sigma公司);将军牌香烟(每支的焦油含量为15 mg、烟气烟碱含量为1.2 mg，山东中烟工业公司);兔抗大鼠icam1抗体、兔抗大鼠mcp1抗体(武汉博士德生物工程有限公司)
1.2 实验分组与动物模型建立
将wistar大鼠随机分为正常对照组、copd模型组、lmwh干预组，每组10只。模型制备：分别于第1、14天气管内注入lps 200 μg(200 μl)，第2～40天(第14天除外)将大鼠置80 cm×60 cm×50 cm大小的有机玻璃熏箱内被动吸烟，每日熏烟2次，每次10支香烟，时间持续1 h，两次熏烟间隔时间4 h。copd模型组熏烟前0.5 h给予1 ml生理盐水皮下注射，每天1次。lmwh干预组熏烟前0.5 h给予lmwh(剂量为150 u/kg)1 ml皮下注射，每天1次。
1.3 观察指标及方法
1.3.1 动脉血气分析 麻醉大鼠仰卧固定于操作台，分离腹主动脉，抽取动脉血0.5 ml，迅速进行血气分析。
1.3.2 支气管肺泡灌洗 迅速打开胸腔，心脏穿刺放血，结扎右肺，解剖暴露出气管，用0.1 mol/l的pbs液10 ml分3次行左肺支气管肺泡灌洗，肺泡灌洗液(balf)总回收率为80%～90%，行细胞计数及分类。
1.3.3 病理学检查 自肺门处分离肺组织，取右下肺叶，置于40 g/l的中性甲醛溶液内固定24 h，常规梯度乙醇脱水、浸蜡、包埋、切片，行苏木精伊红染色，光镜下观察肺组织病理改变。
1.3.4 肺组织形态学定量 应用显微图像分析系统，每张组织切片随机选择5个视野，分别测量肺平均内衬间隔(mli，反映肺泡的平均直径)、平均肺泡数(man，反映肺泡的密度)以及肺泡腔与肺总面积比(paa)，取5个视野的平均值代表所测指标。
1.3.5 icam1、mcp1的检测 采用两步法在石蜡切片上测icam1、mcp1的免疫组化表达，一抗为1∶100的icam1和mcp1多克隆抗体，二抗为生物素山羊抗兔igg，阴性对照标本除以pbs代替一抗外，其他步骤与被测标本相同，阳性反应为胞浆中出现棕黄色颗粒。结果采用多功能彩色病理图像分析系统处理，每张切片在高倍镜下(400倍)随机选择含支气管的视野5个，测量支气管肺组织阳性染色区域的平均积分吸光度(a)值，取其平均值代表所测指标的蛋白表达情况。
1.4 统计学处理
采用spss 11.5及ppms 1.5[3]统计软件对结果进行统计学分析，组间比较采用方差分析。
2 结 果
2.1 肺组织病理学改变
正常对照组大鼠支气管肺组织上皮结构完整，支气管纤毛排列整齐，无杯状细胞明显增生，气管周围无炎症细胞浸润;肺泡结构完整，无扩张融合，无炎症表现，肺泡大小均匀一致。copd模型组呈慢性支气管炎、肺气肿的特征性病理学改变：支气管黏膜纤毛柱状上皮细胞部分脱落、变性坏死，杯状细胞增生;黏膜下层及肌层大量炎症细胞浸润;部分支气管平滑肌明显增厚;管腔内充满大量中性粒细胞、肺泡巨噬细胞及黏液分泌物，大部分肺泡扩张融合，肺泡壁变薄，肺泡直径增大，肺泡隔明显增厚，其中可见炎性细胞浸润，毛细血管扩张充血。lmwh干预组大鼠支气管肺组织损伤的程度较copd模型组轻，支气管周围炎症较轻，杯状细胞增生程度降低，肺泡扩张融合较明显。
2.2 肺组织形态学定量测定
copd模型组mli和paa大于正常对照组，man少于正常对照组，差异有显著性(f=32.02～134.29，q=11.29～22.04，p<0.01);lmwh干预组mli和paa小于copd模型组， man大于copd模型组，差异有显著性(q=4.82～6.92，p<0.01);lmwh干预组mli、paa和man与正常对照组比较，差异均有显著意义(q=6.25～30.36，p<0.01)。见表1。表1 各组肺组织形态学测量结果比较
2.3 动脉血气测定
copd模型组动脉血pao2低于正常对照组，paco2高于正常对照组，差异有显著性(f=36.27、43.96，q=11.89、13.11，p<0.01);lmwh干预组动脉血pao2和paco2与copd模型组比较差异有显著性(q=4.26、8.28，p<0.05、0.01)，与正常对照组比较差异亦有显著意义(q=7.63、4.83，p<0.01)。见表2。
2.4 balf中细胞总数及分类
copd模型组balf中白细胞总数及中性粒细胞百分比高于正常对照组，巨噬细胞百分比低于正常对照组，差异有显著意义(f=106.63～147.83，q=20.50～24.14，p<0.01);lmwh干预组balf中白细胞总数、中性粒细胞百分比低于copd模型组，巨噬细胞百分比高于copd模型组，差异均有统计学意义(q=10.29～14.67，p<0.01)。见表3。
2.5 icam1、mcp1的表达
与正常对照组比较，copd模型组icam1、mcp1表达增强，差异有显著性(f=32.08、56.36，q=4.37、14.95，p<0.01);与copd模型组比较，lmwh干预组icam1、mcp1表达减弱，差异亦有显著性(q=6.87、8.68，p<0.01)。见表4。表2 各组大鼠动脉血气测定结果表3 各组大鼠balf中的细胞总数及分类表4 各组支气管肺组织icam1和mcp1的表达结果比较
3 讨 论
copd的发病机制十分复杂，目前认为与气道炎症、氧化应激和蛋白酶抗蛋白酶失衡有关，有效的抗炎治疗不但能够改善症状，而且能够延缓病程发展，因此抑制气道炎症也成为copd治疗的重要靶向之一。
icam1属黏附分子中的免疫球蛋白超家族，主要表达于内皮细胞、上皮细胞及淋巴细胞等表面，正常情况下icam1呈低水平表达，但当受到炎症因子lps、γ干扰素(ifnγ)以及肿瘤坏死因子α(tnfα)的刺激时，其表达短期内迅速增加。研究显示，icam1在copd病人balf、痰、血浆和肺组织中水平均有一定程度的升高[45]。曾春芳等[6]研究显示，icam1在copd大鼠模型肺组织中表达明显增强，且与balf中的白细胞数及中性粒细胞数呈显著正相关。本研究也证实了icam1在copd大鼠模型肺组织呈阳性表达，表明 icam1参与了中性粒细胞在呼吸道募集，参与了copd的炎症过程。
mcp1是趋化性细胞因子cc家族中的一种，可以趋化单核巨噬细胞进入气道、肺泡间隔和肺泡腔内，激活使其发生呼吸爆发，产生并释放超氧阴离子和溶酶体酶，从而引起肺组织损伤。hautamal等[7]通过在鼠的气管内滴注mcp1诱导巨噬细胞在肺内聚集，并增强香烟诱导肺气肿模型的建立。本研究结果显示，mcp1在copd大鼠模型肺组织中表达明显增强。王慧等[8]研究结果显示，大鼠copd模型组balf中mcp1水平和巨噬细胞总数均高于正常对照组，并且二者呈显著的正相关关系，表明mcp1参与了copd的炎症过程。
lmwh是由普通肝素经化学或酶促方法解聚而成，除作为抗凝血和抗血栓药在临床上广为应用外，近年来其抗炎活性也颇受重视。lmwh抗炎机制涉及炎症细胞、炎症因子和黏附分子等环节。韩秀珍等[9]研究显示，lmwh能抑制icam1在脐静脉内皮细胞(huvec)中的表达，减少致敏豚鼠肠系膜微静脉白细胞的滚动和黏附数目，抑制中性粒细胞与huvec的体外黏附。有研究结果显示，lmwh能抑制肾小球系膜细胞分泌il6，促进内皮细胞释放超氧化物歧化酶，抑制内皮细胞表达mcp1[10]。
吸烟和反复下呼吸道感染是copd发生发展的主要原因。本研究通过被动吸烟加气管内注入lps法建立copd大鼠模型[1112]，其动脉血气与copd的病理生理改变相似，病理形态学光镜观察符合copd病理改变，肺气肿形态学定量分析显示copd模型组mli和paa高于正常对照组，man则低于正常对照组，证明copd动物模型造模成功。copd模型组balf中的白细胞总数增多及中性粒细胞百分比显著高于正常对照组，单核巨噬细胞所占构成比虽低于正常对照组，但巨噬细胞绝对计数增加，肺组织中icam1及mcp1的表达水平明显增强，表明icam1及mcp1参与了气道炎症反应的发生，这与相关文献报道一致。有研究结果显示，肝素雾化吸入后copd病人临床症状明显缓解，肺功能、血气、血黏度等各项指标均有显著改变[13]。我们将lmwh应用于copd大鼠模型的早期干预治疗，结果显示，干预治疗后大鼠肺组织病理及病理生理变化较copd模型组大鼠减轻，mli和paa较copd模型组降低，而man升高，说明lmwh可在一定程度上可减轻copd肺组织损伤。肺组织中icam1及mcp1的表达水平显著下降，黏膜下层、肌层及balf中的炎症细胞数明显减少，但较正常对照组仍有差异，推测lmwh可能通过降低icam1及mcp1的表达，抑制中性粒细胞和巨噬细胞的聚集与活化，减轻气道炎症反应，延缓肺组织的损伤，从而为临床治疗copd气道炎症提供了新思路。
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