【摘要】 目的：研究蕨麻正丁醇提取部位（nbutanol extract of potentilla anserina l., np）对垂体后叶素致小鼠急性心肌缺血损伤的保护作用。 方法：90只雌性昆明种小鼠随机分为正常对照组、缺血模型组、复方丹参组和np低、中、高剂量组，每组15只。除正常对照组外，各组小鼠通过腹腔注射垂体后叶素（20 u/kg）建立急性心肌缺血模型。监测造模前后心电图ⅱ导联j点变化，测定小鼠血清乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, ldh）、肌酸激酶（creatine kinase, ck）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, sod）活性及丙二醛（malondialdehyde, mda）含量，并通过nagarolsen染色观察小鼠心肌缺血损伤程度。结果：与缺血模型组比较，各治疗组缺血所致心电图j点的上移均显著降低（p<0.01）。高、中剂量np及复方丹参可显著降低缺血损伤小鼠血清中ldh、ck活性（p<0.01, p<0.05），提高小鼠血清中sod活力（p<0.01），减少mda的产生（p<0.05），而低剂量np组小鼠血清中ldh、ck、sod活性及mda含量，与模型组比较差异无统计学意义（p>0.05）。nagarolsen染色显示，高、中剂量np及复方丹参可显著减少小鼠心肌缺血损伤红染面积，而低剂量np组仍可见大片红染的损伤心肌。结论：蕨麻正丁醇提取部位对急性心肌缺血损伤具有保护作用。www.11665.cOm
【关键词】 蕨麻; 心肌缺血; 超氧化物歧化酶; 肌酸激酶; 乳酸脱氢酶; 丙二醛; 小鼠
li jy, li y, gong hy, zhao xb, li lz. j chin integr med. 2009; 7(1): 4852.
received may 18, 2008; accepted july 8, 2008; published online january 15, 2009.
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doi: 10.3736/jcim20090107open access
protective effects of nbutanol extract of potentilla anserina on acute myocardial ischemic injury in mice
jianyu li1, yi li1, haiying gong1, xiaobo zhao2, lingzhi li1
1. division of pharmaceutical chemistry, department of preventive medicine, medical college of chinese people's armed police forces, tianjin 300162, china
2. team 061 of department of pharmacy, medical college of chinese people's armed police forces, tianjin 300162, china
objective: to investigate the protective effects of the nbutanol extract of potentilla anserina l. (np) on pituitrininduced acute myocardial ischemic injury in mice.
methods: ninety healthy female mice were randomly divided into normal control group, untreated group, salvia miltiorrhiza group and low, medium and highdose np groups. except for the normal control group, the mice were intraperitoneally injected with pituitrin (20 u/kg) to induce acute myocardial ischemic injury. thirty minutes after induction, electrocardiogram was monitored, and height of the j spot was measured also. activities of lactate dehydrogenase (ldh), creatine kinase (ck) and superoxide dismutase (sod) and content of malondialdehyde (mda) in serum of the mice were detected. the degree of myocardial ischemic injury in mice was observed by nagarolsen staining.
results: the moving up of j spots in the treated groups was significantly inhibited when comparing with the untreated group (p<0.01). compared with untreated group, high and mediumdose np and salvia miltiorrhiza could significantly decrease the activities of ldh, ck (p<0.01, p<0.05), increase the sod activity (p<0.01) and decrease the content of mda (p<0.05). however, no significant difference was observed between lowdose np group and untreated group (p>0.05). nagarolsen staining showed that high and mediumdose np and salvia miltiorrhiza could significantly diminish the areas of cardiac muscles injured by ischemia, but lowdose np had no effect on that.
conclusion: np has a remarkable protective effect on acute myocardial ischemic injury in mice.
keywords: potentilla anserina l.; myocardial ischemia; superoxide dismutase; creatine kinase; lactate dehydrogenase; malondialdehyde; mice
蕨麻，俗称人参果，为蔷薇科植物鹅绒委陵菜potentilla anserina l.的地下块根，是一种分布广泛、蕴藏量大、天然优质的野生藏药资源。其富含淀粉、脂肪酸及人体所需的18种氨基酸和多种维生素，具有较高的医疗和营养价值［1］。研究表明，蕨麻可显著提高小鼠在缺氧状态下的存活率和存活时间，提高心脑的抗缺氧能力［25］，但其是否具有抗缺血作用及具体的有效部位尚不清楚。蕨麻正丁醇提取物（nbutanol extract of potentilla anserina l., np）是本实验室分离得到的蕨麻活性部位，主要含多糖、三萜类化合物及鞣质。通过窒息性缺氧、减压缺氧等实验，表明其具有显著的抗缺氧作用（文章待发表）。本实验在此基础上，建立垂体后叶素致小鼠急性心肌缺血模型，进一步研究蕨麻有效部位的抗缺血作用及可能机制。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂 蕨麻购自青海中药研究所，经鉴定为鹅绒委陵菜根，其乙醇总提物经正丁醇萃取、减压浓缩、冷冻干燥后得其正丁醇部位浸膏（每克浸膏含生药56.5 g，由武警医学院药物化学实验室提取），以0.3%羧甲基纤维素钠（sodium carboxymethycellulose, cmcna）进行药物溶解；复方丹参片，购自天津泰达药业有限公司，批号为060704，0.26 g/片，0.3% cmcna溶解成0.05 g/ml；垂体后叶素，购自上海第一生化药业有限公司；碱性品红，购自天津三英科技开发有限公司；苦味酸和丙酮，购自天津科锐思公司；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, ldh）、肌酸激酶（creatine kinase, ck）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, sod）和丙二醛（malondialdehyde, mda）试剂盒，购自南京建成生物工程研究所。
1.2 实验动物 90只雌性昆明种小鼠，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，许可证号为sck(军)2002001，体质量（27.5±2.5）g。
1.3 实验分组及给药 90只小鼠按随机数字表分组法分为正常对照组（0.3% cmcna）、缺血模型组（0.3% cmcna）、复方丹参组(0.500 g/kg)和高(0.300 g/kg)、中(0.150 g/kg)、低剂量(0.075 g/kg) np组，每组15只。
1.4 急性心肌缺血模型的建立 参照文献［6］建立急性心肌缺血模型。各实验组连续灌胃25 d，1次/d。末次给药后1 h，小鼠腹腔注射乌拉坦1.3 g/kg麻醉，仰卧位固定，将针状电极插入四肢皮下，用动物心电图机（xst5型，广东汕头无线电二厂）（标准电压1 mv=10 mm，纸速50 mm/s）记录正常小鼠ⅱ导联心电图。而后，正常对照组腹腔注射同体积生理盐水，其余各组腹腔注射垂体后叶素（20 u/kg）建立急性心肌缺血模型，30 min后再次记录小鼠ⅱ导联心电图。观察小鼠缺血前后心电图j点电压变化，并以pr段为基线记录各组小鼠j点位移（mv）。
1.5 血清ldh、ck、sod活性及mda含量的测定 小鼠造模后30 min，股动脉取血，5 000 r/min 4 ℃离心，取血清。用比色法测定血清ldh、ck活性，用黄嘌呤氧化酶法测定血清sod活性，用硫代巴比妥酸法测定血清mda含量，具体操作按试剂盒说明书进行。
1.6 nagarolsen染色观察心肌病理改变 取血后，立即将心脏取出，置于4％多聚甲醛内固定，制心肌石蜡切片。常规脱蜡入水，入明矾苏木素液10～30 s，蒸馏水洗，碱性复红染液浸染3 min，蒸馏水、丙酮依次洗涤，0.1%苦味酸丙酮液分化5～10 s。丙酮脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
1.7 统计学方法 计量资料数据以x±s表示，应用spss 10.0统计软件进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，检验水准为α=0.05。
2 结 果
2.1 小鼠心电图j点的变化 造模后30 min，模型组小鼠心电图j点较正常对照组明显上移（p<0.01），各治疗组j点亦明显上移（p<0.01）；与模型组相比，复方丹参及各剂量np均能显著降低缺血所致心电图j点的上移（p<0.01）。见表1。表1 蕨麻正丁醇取提部位对心肌缺血损伤小鼠心电图j点变化的影响
2.2 小鼠血清ldh和ck活性 与正常对照组比较，模型组小鼠血清ldh和ck活性显著升高（p<0.01），各治疗组血清ldh和ck活性亦明显升高（p<0.01, p<0.05）。与模型组相比，复方丹参组及高、中剂量np组血清ldh及ck活性均显著降低（p<0.01, p<0.05）；低剂量np组血清ldh、ck活性与模型组比较差异无统计学意义（p>0.05）。见表2。
2.3 小鼠血清sod活性和mda含量 与正常对照组比较，模型组小鼠血清中sod活性明显下降（p<0.01），mda含量显著增加（p<0.01）；各剂量np组sod活性亦下降（p<0.01，p<0.05），且除高剂量np组外，各治疗组mda含量均明显增加（p<0.01）。与模型组相比，复方丹参组及高、中剂量np组小鼠血清sod活性显著升高（p<0.01），mda含量显著减少（p<0.01）。低剂量np组小鼠血清sod活性、mda含量与模型组比较差异无统计学意义（p>0.05）。见表3。
2.4 心肌nagarolsen染色 光学显微镜下可见，正常对照组心肌组织呈黄染，模型组缺血心肌呈红染。与模型组相比，高、中剂量np及复方丹参组心肌红染面积显著减少，黄染面积增多；而低剂量np组虽有部分组织黄染，但仍可见大片红染的心肌组织。见图1。表2 蕨麻正丁醇提取部位对心肌缺血损伤小鼠血清ldh、ck活性的影响表3 蕨麻正丁醇提取部位对心肌缺血损伤小鼠血清sod活性及mda含量的影响
3 讨 论
垂体后叶素是从动物脑垂体后叶提取的一种水溶性物质，能够收缩血管特别是毛细血管和小动脉，导致血压升高、心肌缺血缺氧。近年来，利用垂体后叶素复制心肌缺血动物模型已应用于筛选抗心肌缺血药物的研究［7，8］。本实验应用垂体后叶素腹腔注射建立小鼠急性心肌缺血模型，通过监测心电图变化、检测血清生化指标及心肌组织特殊染色，观察蕨麻有效部位对小鼠急性心肌缺血损伤的影响。
心电图变化是心肌缺血模型成功与否的最直观的指标。qrs波群的终点与st段交接处称为j点，j点上移，st段抬高或降低0.1 mv以上，t波先高耸后低平者均可视为心肌缺血的心电图表现。通常大鼠、家兔、狗等动物心肌缺血模型的心电图表现可通过st段的变化显示，但由于小鼠心电图st段不明显，故可将j点位移作为判定模型成功与否的观察指标［9］。本研究结果显示，小鼠腹腔注射垂体后叶素后心电图j点明显上移，提示心肌缺血模型复制成功，且阳性对照药复方丹参可显著降低缺血所致心电图j点的上移，进一步印证造模成功；各剂量蕨麻正丁醇提取物可有效降低心肌缺血所致心电图j点的上移，提示其对急性心肌缺血损伤具有一定的保护作用。
ldh是参与细胞能量代谢的一个重要的酶，可以催化乳酸生成丙酮酸，同时产生三磷酸腺苷。心肌缺血损伤时，细胞膜完整性破坏，通透性增加，ldh将从胞浆中释放出来，因此ldh是反映胞膜完整性的重要检测指标［10］。ck也是重要的心肌酶之一，其释放量直接反映了心肌缺血损伤的程度。故血清中ldh、ck活性越高，表明心肌损伤越严重。本实验结果显示，高、中剂量蕨麻正丁醇提取物可显著降低小鼠血清中ldh、ck活性，进一步提示其抗心肌缺血作用。
常规的he染色很难分辨心肌缺血的早期改变，需要通过特殊染色才能显示心肌组织的病理变化。nagarolsen染色的原理为：缺血心肌对复红液的着色力较强，分化时不易脱色。故缺血损伤的心肌组织呈红色；而正常心肌对分化液的抵抗力差，易脱色，故呈黄色或黄棕色［11］。本实验结果显示，高、中剂量蕨麻正丁醇提取物可显著减少缺血心肌的红染面积，从形态学方面说明其对心肌缺血损伤具有明显的保护作用。
心肌缺血时可产生大量的自由基，过多的自由基可激发链式脂质过氧化反应造成细胞膜的损伤，严重时造成细胞的死亡。mda是膜脂质在氧化性极强的自由基作用下发生氧化反应的终末产物，其含量的高低可反映机体受自由基攻击的严重程度。sod是体内清除自由基的重要物质之一，其活力的高低可反映机体清除自由基的能力［12］。本研究结果显示，高、中剂量蕨麻正丁醇提取物可显著提高小鼠血清中sod活性，减少mda的产生，提示其可能通过增强心肌清除自由基的能力，对抗缺血所致的氧化损伤。这也与中药通过提高机体清除氧自由基的能力保护心脑血管抗缺血损伤的观点［13，14］相一致。
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