作者：刘海涛 白宏英 曾志磊 郭耀强 方李鸿
【摘要】 目的 观察重组人生长激素(recombinant human growth hormone， rhgh)对脑缺血/再灌注(ischemiareperfusion， i/r)损伤后神经元细胞凋亡及nestin表达的影响。方法 54只sd雄性大鼠随机分成3组：假手术组、对照组(脑缺血/再灌注+生理盐水组)、治疗组(脑缺血/再灌注+重组人生长激素)，每组18只。应用线栓法制作大鼠脑缺血/再灌注损伤模型，大脑中动脉缺血2h，分别在再灌注7d、14d、21d后处死， 采用tunel法，免疫组织化学法检测顶叶皮质内7d、14d、21d的神经元凋亡和巢蛋白(nestin)的表达。结果 应用重组人生长激素干预后顶叶皮质在7d、14d、21d神经元凋亡数较大鼠对照组明显减少，nestin的表达显著增加。结论 rhgh的神经保护作用可能与抑制缺血神经元细胞凋亡和上调nestin的表达有关。
【关键词】 缺血/再灌注;tunel;重组人生长激素;nestin
【abstract】 objective to investigate the effect of the recombinant human growth hormone (rhgh) on apoptosis and the expression of nestin in male sd rats with cerebral ischemiareperfusion injury. methods the middle cerebral artery ischemiareperfusion injury model was established by middle cerebral artery occlusion (mcao) with nylon suture. fiftyfour rats were randomly divided into 3 groups: the sham group (n=18)， the control group (n=18) and the treatment group (n=18). we used tunel and immunohistochemical method to detect tunelpositive apoptotic cells and the expression of nestin in cortex of parietal lobe on the 7th， 14th and 21st day after ischemiareperfusion injury. results tunelpositive apoptotic cells were decreased in treatment group on the 7th，14th and 21st day， and the expression of nestin was increased obviously in cortex on the 7th， 14th and 21st day. conclusion rhgh could inhibit neural apoptosis and increase the expression of nestin involved in the neuroprotection of rhgh.
【key words】 ischemiareperfusion; tunel; rhgh; nestin
神经细胞损伤过程中，缺血/再灌注损伤与细胞的凋亡有着密切关系[1]，而细胞凋亡起着重要作用，可能是其主要机制之一[2]。WWw.11665.cOM研究发现生长激素具有抗凋亡、抗炎，促进新生血管生成等作用，其在心血管系统、消化系统、烧伤及缺血缺氧脑病方面均已证实。目前，生长激素在脑缺血/再灌注损伤中对细胞凋亡和促进神经干细胞增殖影响的研究较少。本实验通过生长激素对局灶性大鼠脑缺血/再灌注损伤模型的干预，观察其在缺血/再灌注损伤7d、14d、21d顶叶皮质细胞凋亡和nestin的表达情况。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 选用健康雄性sd大鼠，体质量250～280g(由郑州大学实验动物中心提供)，术前12h禁食，术前4h禁水。随机分为假手术组、对照组(脑缺血/再灌注+生理盐水组)、治疗组(脑缺血/再灌注+重组人生长激素组)3组，每组18只，各组间体质量无明显差异(p>0.05)。
1.2 主要试剂和药物 重组人生长激素(长春金赛药业生产)，tunel检测试剂盒及nestin鼠单克隆抗体购自美国 santa cruz公司。
1.3 大鼠脑缺血/再灌注损伤模型的建立及处理 制作大鼠局灶性脑缺血/再灌注采用改良的longa[3]线栓法损伤模型。参照其5级4分制评分标准，将入选的动物，分笼饲养，室温维持20℃左右，正常喂食。治疗组在脑缺血/再灌注损伤模型成功后开始颈部皮下注射重组人生长激素0.1u/(kg·d)，1次/24h，连续注射1周。对照组注射同样剂量生理盐水，注射时间、部位及次数同治疗组。
1.4 组织切片与免疫组化染色 各组分别在造模成功后7d、14d、21d麻醉后以4%多聚甲醛进行组织固定。断头后剥离出脑组织常规固定、石蜡包埋和切片。常规脱蜡、水化，按试剂盒提供的实验步骤进行操作，dab显色，光镜下观察，胞浆出现棕色颗粒为阳性着色。
1.5 免疫组化结果分析 应用德国lecia显微照像系统(上海山富科学仪器有限公司)进行图像采集，用biosens digital imaging systems， v1.6图像分析系统在顶叶区分别随机采集10个视野(400倍)，计数分析切片顶叶区tunel阳性细胞数和计算nestin 染色阳性细胞平均灰度值。
1.6 统计学处理 各组资料结果以(±s)表示，采用spss 13.0软件进行统计学处理，各组数据用单因素方差分析，lsdt法进行两两比较，检验水准α=0.05。
2 结果
治疗组和对照组在7d、14d、21d脑皮质nestin的平均灰度值的变化：治疗组脑皮质nestin的平均灰度值均较同时相的对照组显著增加(p<0.05)，见表1。表1 各组7d、14d、21d nestin的平均灰度值注：◆1组与对照组同一时间点比较，p<0.05;△与假手术组同一时间点比较，p<0.05，1组治疗组和对照组在7、14、21d脑皮质tunel阳性细胞数的平均值变化：治疗组脑皮质tunel阳性细胞数的平均值较同时相的对照组显著的减少(p<0.05)，见表2。表2 各组7d、14d、21d tunel阳性细胞数注:◆1组与对照组同一时间点比较，p<0.05;△与假手术组同一时间点比较，p<0.05
3 讨论
生长激素(growth hormone，gh)是由垂体前叶嗜酸细胞所分泌的191氨基酸的非糖基化蛋白。脑垂体前叶50%的细胞是嗜酸细胞，它所分泌的激素主要是生长激素，其主要功能是促进机体的生长，减少蛋白质的消耗，同时gh与神经内分泌和免疫系统有着密切的联系。gh作为神经内分泌系统与免疫系统之间的“共同语言”，在神经内分泌网络中起着重要的调节作用。研究发现[4]， gh还可能通过抑制酪氨酸磷酸化和干扰素γ所启动的信号转导途径下调诱生型一氧化氮合酶的产生，从而减少细胞毒作用，甚至可以抑制lps 诱导单核细胞产生tnfα，从而减轻炎症反应[5]，这对减轻脑缺血/再灌注损伤后的炎症反应，减少神经功能的损害可能有一定的益处，但减少细胞的凋亡和促进神经干细胞的增殖的研究较少。
本实验发现生长激素治疗组tunel阳性细胞数在7d、14d、21d时均明显少于同一时相的对照组，这表明在缺血/再灌注损伤过程中gh有抑制细胞凋亡的作用;生长激素治疗组nestin的平均灰度值分别在7d、14d、21d时均较同一时相的对照组明显增加，我们推测gh可能具有促使神经干细胞增殖的作用。目前对gh的抗凋亡机制尚有争论。一些研究者认为gh是通过启动丝苏氨酸激酶活性来抑制细胞凋亡的发生[6]，而其他学者认为可能是通过nfkappab介导的信号转导途径产生抗凋亡蛋白bcl2和bag1[78]来抑制细胞的凋亡。而shin等[9]认为gh是通过下调bax和bad的表达水平而不是上调bcl2来减少细胞的凋亡。另外gh还具有抑制caspase8作用，减少ldh的释放和抑制caspase3的活性[10]。总之，gh具有抑制细胞凋亡的作用，且能够增加神经元细胞的数量[1112]，使神经祖细胞的数量增加[13]。christophidis等[14]研究认为gh不仅可以使细胞数目增加，而且使干细胞数目增多，并转化为神经元细胞，神经干细胞的增殖与gh存在剂量依赖性。
本研究结果显示，在大鼠脑缺血/再灌注损伤后给予rhgh治疗，可抑制脑缺血/再灌注损伤后细胞的凋亡，促进细胞的存活和神经干细胞增殖，从而减少神经元细胞的损伤和促进神经元细胞的修复，其具体机制和对神经功能的影响尚不清楚，有待进一步研究，但这可能为临床治疗提供一个新的思路和方法。
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