作者：张祎捷,李现东,陈娜,韩继昌 李四红
【摘要】 目的： 研究 肺癌患者病变组织及血清中血管内皮生长因子（vegf)的表达及其与肺癌生物学特性之间的关系. 方法 ：酶联免疫吸附法(elisa)及免疫组化（sp法）分别检测不同考察因素的肺癌患者和肺炎性瘤样病变患者血清中及肺癌患者癌组织、癌旁组织和肺炎性瘤样病变患者中病变组织中vegf的表达. 结果：血清vegf的表达肺癌患者为（330±65） ng/l，明显高于肺炎性瘤变患者的（143±35） ng/l (p<0.05)；癌组织、癌旁组织及肺炎性瘤样病变组织中vegf的表达率为74.8%，46.3%和18.1%，癌组织中表达率明显高于其余两者 (p<0.05)；肺癌患者vegf的表达与年龄、性别、吸烟史和不同临床分期差异均无统计学意义(p>0.05)，而与癌组织类型、分化程度和淋巴结转移差异具有统计学意义(p<0.05). 结论：vegf在肺癌组织及肺癌患者血清中异常表达，与肺癌患者病变组织的病理类型、分化程度和淋巴结转移呈明显相关性，与肺癌患者的预后有关，vegf表达变化可能成为一些类型肺癌新的诊断标志及基因 治疗 的新靶点.
【关键词】 肺肿瘤；血清；血管内皮生长因子；预后
0引言
血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, vegf），是重要的血管生成正性调节因子，能特异性地促进细胞分裂、增殖及迁移，在肿瘤的发生、 发展 、侵袭过程中起着至关重要的作用，近年来的许多研究证实：vegf与肺癌的新生血管和淋巴管的生长以及肿瘤的生物学行为密切相关. 我们通过免疫组化和酶联免疫吸附法比较不同临床特征的肺癌患者与非肿瘤性肺部病变患者的肺组织及血清中vegf的不同表达，探讨肺癌患者肺组织及血清中vegf的表达与患者年龄、性别、吸烟史以及肺癌组织类型、淋巴结转移、分化程度、临床分期等相关因素的关系，旨在揭示其与疾病预后和复发的相关性.
1对象和方法
1.1对象选择我院200501/200612经病 理学 检查证实肺癌患者的石蜡标本65（男40，女25）例，年龄36～75平均 (55±9)岁. （同时取患者外周静脉血）按1997年uicc修订标准进行tnm分期：ⅰ期20例，ⅱ期17例，ⅲ期17例，ⅳ期11例. 按病理形态学分为：鳞状细胞癌38例，腺细胞癌27例. 按分化程度分为：高、中分化31例，低分化及未分化癌34例. 所有患者术前均未接受过化疗或放疗治疗. 肺炎性病变组选取同期在我院手术切除并经病理确诊肺炎性假瘤及肺结核患者标本31（男19，女12）例，年龄40～72平均（54±7）岁. 作为对照组. 经构成比比较（χ2检验），肺癌组与肺炎性病变组患者的性别及年龄构成比均一致（p<0.05）. 兔抗人vegf mab即用型sp试剂盒（福州迈新公司）；血清检测elisa试剂盒（美国g.b公司）.
1.2方法
1.2.1标本采集所有患者于治疗前空腹抽取静脉血2 ml（不含抗凝剂），静置后，取血清用于vegf的检测.
1.2.2免疫组化染色将待检测标本统一切成4 μm厚石蜡切片，提取组织细胞，按试剂盒说明进行免疫组织化学（sp法）染色. 步骤如下：石蜡切片（载玻片经apes胶处理）60℃烤片4 h. 切片按常规脱蜡至水. 3 g/l过氧化氢去除内源性过氧化物酶，10 min，水洗. 40 g/l胃蛋白酶30℃~32℃消化10 min，水洗. 0.01 mmol/l柠檬酸缓冲液内加热至90℃后，计时10 min，室温下 自然 冷却. 0.05 mmol/l tris缓冲液2 min×3次，滴加正常鼠血清20 min，滴加兔抗ar mab（浓度为1∶50）4℃过夜；0.05 mmol/l tris缓冲液2 min×3次，滴加生物素化羊抗鼠igg（浓度为1∶200）室温下30 min；0.05 mmol/l tris缓冲液2 min×3次，滴加streptperoxidase（浓度为1∶200）室温下40 min，dab显色，镜下控制. 苏木素复染细胞核、脱水、透明、封片并照相.
阳性染色为肿瘤细胞浆内出现棕色颗粒. 组织vegf表达结果判定标准：染色强度：0=未染色，1=弱染色，2=中等染色，3=强染色. 细胞染色百分率：0为0%阳性细胞，1为<25%阳性细胞，2为25%～50%阳性细胞，3为>50%阳性细胞. 采用染色强度+细胞染色百分率为记分方法，标准：0分为(-)，1～2分为(+)，3～4分为()，5～6分为(). 表达程度的划分界限：(-), (+)为阴性表达，(), ()为阳性表达.
1.2.3elisa检测按试剂盒步骤进行. 将抗人vegf mab包被于酶标板上，然后加样使标准品或样品中的vegf与mab结合，随后加入生物素化的抗人vegf，在酶标板上形成免疫复合物，最后加入辣根过氧化物酶标记的streptavidin与生物素结合并加入酶底物邻苯二胺（opd）进行显色. 采用labsystem全自动酶标仪测a450 nm值. 根据标准品不同浓度及所读取a450 nm值，取双对数得直线回归方程并符合说明书要求，依直线回归方程求出样品vegf浓度. 结果直接用浓度值（ng/l）高低表示. 上述两个检测 内容 的所有标本均同时做三个复样检测，取其算术平均值作为一次的结果，重复操作3次.
统计学处理：结果采用spss 11.5统计软件进行统计 分析 . 两样本比较采用χ2检验，计量资料以x±s表示，用组内两样本之间的t检验或近似t检验. p<0.05为差异具有统计学意义.
a: vegf在肺癌组织中的表达; b: vegf在癌旁组织中的表达; c: vegf在肺炎性瘤样病变患者肺组织中的表达.
图1免疫组化检测
2结果
2.1vegf在肺癌组织及细胞中的表达肺癌组织和细胞中vegf表达阳性率为（75.6±2.4）%（表达呈强阳性），明显高于癌旁组织和细胞（43.2±2.1）%（表达阳性者呈中度阳性）( p<0.05)，也明显高于炎性瘤样病变组织和细胞（15.7±1.8）%（表达阳性者为弱阳性）( p<0.05)，而在癌旁组织和细胞中vegf表达量明显高于炎性瘤样病变组织和细胞差异具有统计学意义( p<0.05，图1).
2.2血清中vegf表达血清vegf的表达在肺癌患者组为（330±65） ng/l；炎性病变患者组为（143±35） ng/l，肺癌组表达量明显高于炎性病变组表达量，组建差异具有统计学意义（p<0.05）.
2.3vegf在不同疾病相关因素肺癌患者癌组织内和血清中的表达vegf表达与患者年龄（以60岁为界线）、性别、吸烟史、肿瘤分期均无明显关系；与肿瘤组织类型、淋巴结转移及分化程度有关；腺癌患者癌组织内表达量显著高于鳞癌患者（p<0.05）；有淋巴结转移者癌组织内表达量显著高于无淋巴结转移者（p<0.05）；低、未分化型患者癌组织内表达量显著高于中、高分化型患者（p<0.05，表1，2）.表1vegf在不同疾病相关因素肺癌患者癌组织中的表达表2vegf在不同疾病相关因素肺癌患者血清中的表达
3讨论
vegf促肿瘤生长的作用主要是通过促进肿瘤的血管新生来实现的. 它对肿瘤血管内皮细胞的增殖和迁移等发挥着重要作用［1］. 有 研究 ［2-3］发现vegf在肺癌组织及血清中的表达水平显著高于肺炎性瘤样病变患者. 而且vegf表达量与许多疾病相关因素密切相关，结果提示vegf在肺癌患者早期诊断、预后判断和临床 治疗 中发挥重要作用.
本研究结果发现，肺癌患者的癌组织中和血清中vegf的表达水平显著高于癌旁组织和肺炎性瘤样病变患者，与国内外研究［4-5］报道的结论基本一致. 这表明其可能早期就参与肺癌细胞的增殖，与肺癌的发生、 发展 ，从而预示着其作为肺癌早期诊断的分子标志物之一的可能性以及vegf为靶点的疗法具有较好的靶向特异性. 本研究同时还发现腺癌患者、低（未）分化癌患者、有淋巴结和远处转移患者体内vegf的表达水平分别显著高于鳞癌患者、中（高）分化患者、无淋巴结和远处转移患者，vegf的表达水平与患者的年龄、性别、吸烟史、肿瘤大小及临床分期均无明显相关性. 这一结果也与 文献 结构报道的相一致［6-8］. 表明检测vegf的表达对恶性程度、病情轻重的预测无明显价值. yuan等［6］研究发现肺腺癌和鳞癌的vegf表达明显升高，而肺腺癌的表达又较肺鳞癌为高. 梁瑞韵等［9］及孙杰等［10］的研究认为vegf的表达与组织类型无明显相关性. 出现上述结果的主要原因可能是肺癌患者的组织类型和临床分期以及本身的生物学复杂性有一定关系. 而vegf只是其中的因素之一，而且它的作用受到其他许多因素的调节和 影响 . vegf作为一个影响肺癌进展的重要的细胞因子，至少从 目前 的研究来说，尚不能单独地反映疾病的预后. 但本研究的结果表明vegf在肺癌中的表达可以促进肿瘤的发生及恶性转化，增加肿瘤淋巴管侵袭和局部淋巴结转移的可能性，因此它可以较好地评判肿瘤的恶性程度、反映肿瘤的侵袭力及转移能力，可以成为反映淋巴结转移和癌灶转移的重要指标之一，有助于对肿瘤预后的判断.
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