【摘要】  　　目的: 应用比较蛋白质组学的方法分析丙型肝炎患者外周血单个核细胞蛋白质表达模式的变化及寻找丙型肝炎相关生物标记分子, 进一步识别鉴定其差异表达蛋白质, 分析其对丙型肝炎慢性化机制的意义。方法: 应用固相化ph梯度双向凝胶电泳(2-de)分离健康者(10)及hcv患者(28)pbmc的总蛋白质, 凝胶银染显色后, pdquest图像分析软件进行比较分析、识别差异表达的蛋白质, 应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tof-ms)获得差异蛋白点的肽质指纹图谱, 通过swiss-prot数据库鉴定蛋白质。结果: 得到两张2-de图谱, hcv患者及健康者pbmc凝胶的蛋白质点数分别为625及614; 初步筛选出hcv患者与健康者存在明显差异的12个蛋白点, 经质谱分析,初步鉴定了10种蛋白质。这些差异蛋白质包括病毒蛋白、 蛋白质合成与分解、 三大代谢相关酶类、 细胞结构相关蛋白质以及信号转导相关蛋白质。结论: 应用2-de及maldi-tof-ms方法建立了hcv患者pbmc双向凝胶电泳图谱,分离并初步鉴定了10种与hcv感染相关的差异表达的蛋白质, 为研究hcv慢性化相关机制提供新的线索。

【关键词】  丙型肝炎病毒 蛋白质组学 pbmc 2-de maldi-tof-ms

　　mass spectrometric analysis of peripheral blood mononuclear cells in hcv infected patients

　　chu chun-li, deng xiao-zhao*, zhang yun, dong li-li, wang zhong-can, yu rong-bin, wu chao

　　school of basic medicine, nanjing medical university,  center of disease prevention and control, nanjing command,  nanjing 210029,  china

　　［abstract］  aim: to investigate the diversity of proteins’ pattern of the peripheral blood mononuclear cells (pbmcs) in patients with hepatitis c virus (hcv) infection, identify the differentially expressed proteins and analyze their roles in the mechanism of chronic hepatitis c. methods: the total proteins from pbmcs in hcv infected patients (28) and healthy persons (10) were separated by the immobilized ph gradient-based 2-de. the differentially expressed proteins were screened by pdquest analysis software, and then identified by peptide mass fingerprint (pmf) based on matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (maldi-tof-ms) and database searching. results: 2-de results showed that the mean number of protein spots in hcv infected patients and healthy persons was 625 and 614.twelve differential proteins were tested by maldi-tof-ms, and 10 of them were identified. some of the proteins participated in protein synthesis and degradation, signal transduction, metabolism, or cytoskeleton construction while some of them were proteins of virus. conclusion: 2-de pattern of pbmcs from hcv infected patients or healthy persons has been established and ten differentially expressed proteins has been characterized. our study is helpful for clinical detection of hcv infection and further research into the mechanisms of chronic hepatitis c.

　　［keywords］hcv; proteomic; pbmc; 2-de; maldi-tof-ms

　　丙型肝炎病毒（hepatitis c virus, hcv）感染所引起的丙型肝炎呈全球分布。Www.11665.coM据who估计, 目前全世界约有1.8亿hcv感染者, 且呈增长趋势。hcv感染所致的丙型肝炎慢性化率高达75%~85%, 可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化, 部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌, 对人类的健康和生命构成严重威胁［1］。丙型肝炎慢性化的机制目前还不清楚, 研究表明丙型肝炎的发生和发展与患者的细胞免疫功能有关。人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,  pbmc) 为免疫活性细胞的集合体, 富含t淋巴细胞,其在机体抗hcv感染中起着极为重要的作用［2］ 。pbmc是hcv肝外存在和复制的重要场所, 已经有研究表明病毒在pbmc中的复制是hcv逃避免疫杀伤和丙型肝炎慢性化的重要机制［3, 4］。 采用蛋白质组学方法研究pbmc蛋白质表达谱、 寻找丙型肝炎相关生物标记分子对于hcv的早期诊断、 治疗及预后监测具有重要意义。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  丙型肝炎患者全血标本来源于解放军八一医院、南京大学医学院附属鼓楼医院。病例组共28例, 均未应用干扰素治疗, 其中男15例, 女13例, 年龄20～70岁。血清hcv-rna均为阳性, alt均升高, 其中诊断为慢性丙型肝炎26例。正常对照组共10例, 标本来自南京市血站的健康献血者, 男女各5例, alt均正常, 排除hcv、hbv、eb等感染。2d quant kit定量试剂盒、 尿素、 硫脲、 np-40、 tritonx-100、 二硫苏糖醇(dtt)、 碘乙酰胺及固相ph梯度干胶条(ipg strip ph3-10nl,  24 cm)等均为amersham biosciences产品;   过硫酸铵、 丙烯酰胺、 甲*双丙烯酰胺、 甘氨酸、 硫代硫酸钠、 碳酸氢铵、 铁氰化钾、 三氟乙酸及乙腈等为sigma-aldrich公司产品;    胰蛋白酶(trypsin)为promega公司产品; 余为国产分析纯。ipgphor等电聚焦仪、 ettan dalt垂直电泳槽及image scanner扫描仪购自amersham biosciences公司; 低温高速离心机购自beckman公司; 恒温水浴箱购自英国grant公司; 真空冷冻干燥仪购自thermo electron公司; voyagerde str 4307 maldi-tof-ms质谱仪、 labscan扫描软件及data explorer质谱分析软件均购自applied biosystem公司; pdquest双向凝胶图谱分析软件为bio-rad公司产品; mascot distiller质谱信号峰识别软件及mascot肽质量指纹图数据库查询软件为matrixscience公司产品。

　　1.2  方法

　　1.2.1  pbmc分离及蛋白质样品制备  收集确诊的hcv患者和健康者的静脉抗凝全血; 用ficoll淋巴细胞分离液分离pbmc, pbs缓冲液洗涤细胞沉淀至上清液的hcv-rna为阴性止; 向细胞中加入含蛋白酶抑制剂的tris-hcl缓冲液快速冻融,加入dna酶和rna酶,去除样本中的脱氧核糖核酸与核糖核酸,冰浴10 min。真空冷冻干燥蛋白样品后用裂解缓冲液溶解。采用考马氏亮蓝g250法经紫外分光光度计对蛋白质样品定量。电泳前4℃,12 000 r/min离心。

　　1.2.2  双向凝胶电泳  分别取2组细胞蛋白质样品与适量容涨缓冲液混匀, 加入ipg干胶条置于ipgphor水平电泳仪电极板上, 等电聚焦电泳, 电泳结束后将ipg胶条置入平衡缓冲液中。平衡后ipg胶条转移至mul2tiphorⅱ电泳系统,行sds-page第二向电泳。电泳凝胶行硝酸银染色［5］。

　　1.2.3  凝胶扫描与图像分析  用高分辨率扫描仪对银染的凝胶进行扫描, 用pdquest图象分析软件依次进行点检测、 背景消减、 标准化、 匹配、 建立平均凝胶、 比较差异等分析产生差异表达蛋白点数据信息。

　　1.2.4  质谱样品制备  选取较浓的差异点在图像上做好标记,切割银染蛋白质点置eppendorf管中,经过脱色、 还原、 碘乙酰胺烷基化、 酶解、 超声处理、 离心后, 取上清液进行脱盐,  最后与饱和cca基质液混合, 点样于不锈钢板上, 室温干燥后备用。

　　1.2.5  肽质量指纹图谱分析  制备好的样品置于基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱(maldi-tof-ms)仪上进行分析。采用线性模式、 正离子谱测定。离子源加速电压1为20 kv, 加速电压2为18.85 kv,  n2激光波长337 nm, 脉冲宽度为3 ns, 离子延迟提取400 ns, 真空度4×10-7torr,质谱信号单次扫描累加50次,并用基质峰和胰蛋白酶自动降解离子峰作为内标校正质谱峰,获得肽质量指纹图谱pmf［6］。

　　1.2.6  数据库查询  对所获得的肽质量指纹图用mascot: peptide mass fingerprint中swiss-prot 数据库查询(http://au.expasy.org/sprout/) , 再结合双向凝胶电泳相应点的表观等电点、 相对分子质量(mr)、 匹配肽段的多少和覆盖率等进行综合分析、 鉴定蛋白质。

　　2  结果

　　2.1  健康者与丙型肝炎患者pbmc的2-de图谱  健康者与丙型肝炎患者的外周血单个核细胞表达的蛋白质进行双相凝胶电泳, pbmc总蛋白质经双向凝胶电泳分离, 银染显色后得到背景清晰、 分辨率高的2-de图谱并进行匹配, 其中a为健康者组, b为丙肝患者组; 水平轴为等电点方向,  垂直轴为mr方向; 数字所示为差异蛋白点。健康者及hcv患者pbmc凝胶的平均蛋白质点数分别为614及625（图1、  2）。

　　图1  健康者与丙肝患者的pbmc的2-de图谱匹配结果（略）

　　fig 1  the matching result of 2-d gel map of proteins from pbmc of hcv infected patients and healthy persons

　　图2  健康者与丙肝患者的pbmc蛋白质双向电泳图谱（略）

　　fig 2  2-d gel map of proteins from pbmc of hcv infected patients and healthy persons

　　a: the map of healthy persons; b: the map of hcv infected patients.

　　2.2  丙型肝炎患者蛋白组表达变化  两组蛋白电泳基本类似,蛋白点集中分布于pi4～10间的区域(图2a, b ) , 通过pdquest软件分析健康者与丙肝患者pbmc差异表达的蛋白质, 选取标记好的差异蛋白质点共12个分别切割银染通过胶内原位酶解进行maldi-tof-ms分析,分别得到其中10个蛋白点的肽质量指纹图谱。并以胰蛋白酶自切降解峰作为内部标准校正, 获得10张pmf。利用mascot distiller软件搜索swiss-prot和ncbi蛋白质数据库, 将查询到的结果再结合双向凝胶电泳图谱上相应点的表观等电点、 mr、 匹配肽段的多少(4个片段以上)和覆盖率(>15%)等进行综合分析, 寻找与之匹配的相关蛋白质, 鉴定的蛋白质名称及相应的mr和等电点见表1(序号同图2a, b)。

　　表1  通过肽质量指纹谱初步鉴定的差异蛋白点（略）

　　tab 1  differential protein spots identified preliminarily by peptide mass fingerprinting

　　3  讨论
   
　　pbmc是机体重要的免疫细胞, 在多种疾病发生、 发展、 治疗及预后判断过程中发挥重要作用［1, 4］。蛋白质组学是在整体上研究细胞内蛋白质的组成及其活动规律的一门学科, 研究的是在不同时空发挥功能的特定蛋白质群。通过差异蛋白质组研究可以识别参与细胞生命活动过程中的重要蛋白质, 为深入探索其机制提供信息。我们将丙型肝炎患者与健康者pbmc表达的蛋白质分别进行双向凝胶电泳和maldi-top-tof串联质谱分析, 找到有差异表达的10个蛋白。通过mascot数据库检索和相关资料的查阅, 确定出其中具有进一步研究意义的差异蛋白: 磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, pi3k)及病毒蛋白hcv-f蛋白, 推测它们在hcv感染慢性化中的功能。
    　　
　　磷脂酰肌醇-3激酶由一个催化亚基（mr 11 000,  p110 ）和一个调节亚基（mr 85 000,  p85 ）所构成。p85的氨基端含有sh3结构域和能与sh3结构域结合的富含脯氨酸区域, 羧基端则含有2个sh2结构域及一个与 p110结合的区域。pi3k的p110 与蛋白激酶同源, 且本身既磷脂酰肌醇激酶的活性, 也具有ser/thr激酶的活性［7］。pi3k是许多生命活动中关键的信号分子, pi3k介导的信号转导通路调节细胞的分裂、 分化、 凋亡等活动［8］。近年发现, pkb（protein kinase b）是pi3k下游直接的靶蛋白, pi3k产生的脂类第二信使pi-3, 4, -p2和pi-3, 4, 5-p3等均能与pkb和磷酸肌醇依赖性蛋白激酶(pdk)结合并活化。pdk能使pkb磷酸化而激活,  激活的pkb又进一步激活抗细胞凋亡机制、 葡萄糖代谢（糖原合成、 糖酵解及葡萄糖的摄取）及蛋白质合成等过程,  从而促进细胞的生长和增殖［8］。近来的研究发现hcv ns5a能够直接与pi3k p85调节亚基的sh3结构域相互作用, 导致akt/pkb磷酸化程度增加, 从而使hcv亚基因组复制子或单独表达ns5a的细胞系免于凋亡,  提示hcv ns5a可能是发展hcc的间接机制［8］。本课题组利用基因重组克隆技术在hepg2细胞中表达hcv的ns5a基因,  检测其pi3k蛋白的表达。实验结果表明hcv ns5a可在体外激活pi3k, 进而激活其后续的信号通路, 导致akt/pkb磷酸化程度增加, 从而使hcv亚基因组复制子或单独表达ns5a的细胞系免于凋亡, 提示hcv ns5a可能是发展hcc（慢性丙型肝炎）的间接机制［9］。
    　　
　　丙型肝炎病毒f蛋白, 是由hcv核心蛋白编码序列在翻译时发生核糖体读码框移位产生, 被命名为新型c蛋白或arfp（alternative ribosomal frame shift protein）或f（frame shifting）蛋白［10］。已发现它不稳定, 在体外细胞实验中半衰期约10 min , 免疫荧光染色及亚细胞分布实验发现f蛋白位于细胞质中, 主要与内质网相连, 推测在此发挥其功能。branch等［11］报道, 在对hcv相关的肝细胞癌患者癌组织进行体外培养时, 获得高表达的f蛋白, 定量rt-pcr显示核心蛋白水平降低并伴随f蛋白高表达, 推测后者竞争性地抑制了前者表达; 并且认为f蛋白可能与hcv感染的慢性化有关。f蛋白是自然感染hcv过程中产生的, 其在不同基因型hcv中的高度保守性和可刺激患者产生相应抗体, 显示f蛋白在hcv感染与免疫中起重要作用。目前课题组通过原核表达hcv-f蛋白, 用以检测不同临床类型丙型肝炎患者体内抗体, 并制备抗血清［12］。这些工作将有助于进一步研究hcv-f蛋白的功能以及与hcv感染的关系。从而为hcv相关疾病的诊断和治疗及研究hcv慢性化相关机制提供线索。