非小细胞肺癌病人外周血muc1基因定量表达及意义
【关键词】 ca153抗原 癌，非小细胞肺 逆转录聚合酶链反应
【摘要】 目的 探讨mucin1（muc1） mrna在非小细胞肺癌（nsclc）病人外周血中的表达及临床意义。方法 采用实时荧光定量rtpcr方法检测muc1 mrna在nsclc病人外周血中的表达。结果 nsclc病人外周血中muc1 mrna表达显著高于正常人（t=2.01，p<0.05）；鳞癌与腺癌病人muc1基因的表达无明显差异（p>0.05）。nsclc病人外周血中muc1 mrna表达与nsclc的病理分级、tnm分期及淋巴结转移密切相关(f=25.62、34.61，t=2.05，p<0.05）。结论 nsclc病人外周血中muc1 mrna表达与nsclc发生、发展、侵袭、转移及恶性程度密切相关，对判断nsclc恶性程度及预后有重要参考价值。
【关键词】 ca153抗原 癌，非小细胞肺 逆转录聚合酶链反应
quantitative expression of muc1 mrna in peripheral blood and its clinical significance in patients with nonsmall cell lung cancer
jin xiangfeng, luo yiren, wang mingzhao, et al
(department of thoracic surgey, the affiliated hospital of qingdao university medical college, qingdao 266003, china);
［abstract］ objective to explore the expression and clinical significance of muc1 mrna in peripheral blood of patients with nonsmall cell lung cancer (nsclc). methods the expression of muc1 mrna in peripheral blood of nsclc patients was detected by realtime fluorescent quantitative rtpcr. results the expression of muc1 mrna in the patients was singnificantly higher than that of healthy controls (t=2.01,p<0.05). no significant difference of muc1 mrna expression was noted between the patients with squamous carcinoma and adencarcinoma (p>0.05). levels of muc1 mrna were closely correlated with pathological grade,tnm stage and lymphatic metastasis (f=25.62,34.61;t=2.05;p<0.05). conclusion levels of muc1 mrna expression in patients with nsclc closely correlates with the occurance, development, invasion, metastasis and extent of malignancy of the disease, which are of a great reference in estimating the malignancy and prognosis of nsclc.
［key words］ ca153 antigen; cancer, nonsmallcell lung; reverse transcriptase polymerase chain reaction
肺癌是呼吸系统常见的恶性肿瘤，目前已成为国内外发病率和死亡率均位居首位的的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌（nsclc）的术后5年生存率仅30%左右。wwW.11665.CoM即使是完全切除的ⅰ期nsclc，仍有约25%～50%的病人术后短时间复发，很重要的原因就是术时已存在微转移[1]。mucin1(muc1)黏蛋白(简称muc1),是一种ⅰ型跨膜蛋白,正常情况下主要表达于多种组织、器官中上皮细胞近管腔或腺腔面,呈顶端表达,极性分布[23]。最近的研究表明,在多种肿瘤中muc1 异常表达,并成为一种潜在的肿瘤生物学标志物。本研究旨在通过实时荧光定量pcr技术检测nsclc病人外周血中muc1 mrna表达及其与肿瘤相互关系，以明确muc1 mrna在nsclc发生、发展中的意义，为开发新的nsclc诊治方法提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 标本来源
本文48例nsclc外周血标本均取自2007年3—7月间我院胸外科肺癌手术病人，均有明确病理诊断。其中男27例，女21例；年龄37～76岁，平均62.6岁。鳞癌28例，腺癌20例；高分化10例，中分化27例，低分化11例；淋巴结阳性18例，阴性30例；按uicc 1997年肺癌ptnm分期标准:ⅰ期15例，ⅱ期18例，ⅲ期10例，ⅳ期5例。同时，取正常人外周血20例作为对照。所有标本均置普通试管中立即放入冰盒中冷藏，尽快提取外周血中rna后快速冷冻，-70 ℃冰箱保存。
1.2 试剂及来源
rnaprep blood kit 血液总rna提取试剂盒、无水乙醇、β巯基乙醇及实验器材均购自北京天根生物工程技术服务有限公司；凝胶回收试剂盒、ta克隆载体、realtime pcr master mix均购自大连宝生物公司；小量质粒抽提纯化试剂盒购自上海华舜生物工程公司； easyhyb、工具酶等由我院中心实验室提供。
1.3 检测方法1.3.1
构建人muc1、gapdh mrna的标准品首先进行muc1 mrna片段的克隆及检测，从nsclc病人及对照组外周血标本中提取rna，进行反转录反应后pcr扩增并回收纯化产物，制备感受态细胞并进行目的片段的ta克隆，提取质粒并鉴定重组质粒后制作标准曲线。制备muc1引物，序列为: 5′(fam)cagtgtgtggaagctcatgtgggcc3′(tamra)，长25 bp;gapdh: 5′(fam)tcatcagcaatgcctcctgcacca3′(tamra)，长24 bp。基因测序证实所克隆基因片段为目标基因片段，合成目标基因片段的荧光探针由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。
1.3.2 rna的提取
取nsclc病人及对照组新鲜血液1 ml，用edta抗凝。按照rna提取试剂盒说明书提取rna，测吸光度值，-70 ℃保存。
1.3.3 反转录反应
按照realtime pcr master mix反转录反应试剂盒说明书进行muc1 mrna提取物的反转录扩增。
1.3.4 muc1基因片断的实时荧光定量rtpcr检测
根据不同浓度的质粒标准品的扩增曲线,在sds软件下系统自动生成标准曲线,通过标准曲线方程和样品的荧光相对值计算出样品中所测基因的含量。按照实时荧光定量rtpcr反应试剂盒要求构建反应管中反应体系，按照反应条件进行荧光定量pcr反应。用7500荧光定量pcr扩增仪完成pcr反应后，自动生成荧光强度曲线，该荧光强度曲线反映所有标本不同循环时的荧光强度；电脑同时算出反应体系中待测样本中muc1及gapdh mrna的拷贝数。
2 结果
2.1 muc1 mrna在nsclc及正常对照组外周血中的表达
在本组48例nsclc病人外周血中，muc1及gapdh的mrna均有表达，阳性率为100％；对照组中muc1及gapdh的mrna均无表达，阳性率为0;nsclc病人及对照组外周血中muc1 mrna的拷贝数分别为2.67±0.27、1.43±0.17，两组比较差异有显著性(t=2.01,p<0.05)。
2.2 nsclc病人muc1 mrna的表达与临床病理特征的关系
鳞癌与腺癌病人muc1 mrna的表达差异无显著意义（t=2.02，p>0.05）；muc1 mrna表达量与nsclc的病理分级、tnm分期及淋巴结转移密切相关(f=25.62、134.61，t=2.05，p<0.05）。见表1。表1 nsclc病人外周血muc1 mrna的表达与临床病理特征的关系（略）
3 讨论
muc是广泛分布于机体正常各种黏膜表面的高分子质量糖蛋白,迄今已发现有13种[23]。其中muc1是一种ⅰ型跨膜蛋白[4],在正常的肺、支气管组织中和nsclc的癌组织中均有表达，但在正常人体的外周血中该基因无表达或低表达，如果在nsclc病人的外周血中检测到muc1 mrna较高表达，就可考虑为癌转移。muc1对肿瘤细胞的黏附作用具有双向调节功能。肺癌病人生存率较低的主要原因是肿瘤的复发和转移, 根据muc1的生物学功能及其与肿瘤的关系，最近有多项研究表明，muc1 mrna在外周血的表达是检测肺癌病人癌转移的一个有价值的指标, 可为制定治疗方案和评估预后提供重要参考依据[5,6]。本研究采用先进的荧光定量pcr技术，定量检测muc1 mrna在nsclc外周血的表达，结果显示，在48例nsclc病人外周血中，muc1及gapdh的mrna均有表达，阳性率为100％，阴性对照组中muc1及gapdh的mrna均无表达，阳性率为0；nsclc病人外周血中muc1的mrna表达明显高于正常对照，差异有显著性；鳞癌与腺癌muc1的mrna的表达量无明显差异；muc1 mrna的表达在不同tnm分期之间、肿瘤分级之间及淋巴结有无转移之间均有显著性差异，因此认为，nsclc病人外周血中muc1 mrna的表达水平可作为判断其恶性程度、治疗效果和预后的指标。已有研究结果显示，muc1 mrna在nsclc组织中的阳性表达率与肺癌病人的预后呈负相关, muc1 mrna阳性表达率越高, nsclc病人术后平均生存时间越短, muc1 高表达的nsclc 病人生存期明显小于低表达病人[7]。另有研究联合肺部ct和血清muc1检测进行放、化疗前后疗效判断，结果显示，伴血清muc1高的肺癌病人, 若在化疗后肿瘤缩小、症状改善, 同时muc1也相应降低, 肺癌病人的预后就较好; 而化疗无效或进展期肺癌病人血清muc1含量有上升趋势, 其发生复发和转移的可能性也较大[8], 说明血清muc1含量与疗效呈负相关。
至于肿瘤tnm分期越晚、分化越差及淋巴结转移导致muc1 mrna高表达的机制，我们认为与muc1对肿瘤细胞的黏附作用及对机体免疫应答双向调节作用密不可分，有必要进行相关机制的进一步研究。
总之，nsclc病人外周血中muc1 mrna表达与nsclc发生、发展、侵袭、转移及恶性程度密切相关，对判断nsclc恶性程度及预后有重要参考价值。
【参考文献】
[1]金翔凤,魏煜程,王明钊,等. 非小细胞肺癌病人外周血ck19 mrna表达及意义[j]. 齐鲁医学杂志, 2008,23(3):204206.
[2]williams a j, meguckin m a, gotley d c, et al. two novel mucin genes downregulated in colorectal canceridentified by differential display[j]. cancer res, 1999,59(16):40834089.
[3]williams s j, wreschner d h, tran m, et al. muc13: a novel human cell surface mucin expressed by epithelial and hemopoietic cell[j]. j biol chem, 2001,276(21):1832718336.
[4]meseguer m, pellicer a, simon c. muc1 and endometerial receptivity[j]. mol human reproduction, 1998,4(12):1089.
[5]郑顺利,杨庆生,马小红. 非小细胞肺癌患者纵隔淋巴结和外周血中muc1 基因的检测及意义[j]. 第三军医大学学报, 2006,28(24):2472.
[6]倪崇俊,黄建安,马家用. 非小细胞肺癌化疗前后肿瘤标记物ca153、cea、ca125、ca199 水平的变化及其意义[j]. 苏州大学医学学报, 2005,25(3):474.
[7]蔡祖勋,梁庚正,张学完,等. 非小细胞肺癌组织中p53 和muc1 的表达及其意义[j]. 肿瘤防治杂志, 2004,11(7):694.
[8]张哲民. 联合检测血清cyfra211、ca153 及nse 在肺癌诊治中的临床意义[j]. 中国癌症杂志, 2005,15(6):566.
